RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

Summary

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה ב ג elegans באמצעות מסך RNAi מבוסס גנומית transgene משולב המבטא חלבון פונקציונלי, מתויג fluorescently.

Abstract

סי אלגנס הוכיחה להיות מערכת מודל ערך לגילוי ואפיון פונקציונלי של גנים רבים ושבילים גנים ^1. כלים מתוחכמים יותר ומשאבים ללימודי במערכת זו יש להקל על הגילוי המתמשך של גנים עם פנוטיפים או תפקידים יותר עדינים.

כאן אנו מציגים פרוטוקול כללית התאמנו לזיהוי ג elegans גנים עם פנוטיפים postembryonic בעלי עניין באמצעות RNAi ^2. הליך זה שונה בקלות assay הפנוטיפ של בחירה, בין אם על ידי אופטיקה אור פלואורסצנטי או על מיקרוסקופ לנתח או תרכובת. זה פרוטוקול ההקרנה מנצל את הנכסים הפיזיים של האורגניזם וכלים מולקולריים ג הקהילה elegans המחקר הפיק. כדוגמה, אנחנו מדגימים את השימוש transgene משולבת המבטאת מוצר ניאון במסך RNAi לזהות גנים הנדרשים לוקליזציה רגיל לכךהמוצר הזחלים בשלב מאוחר ומבוגרים. ראשית, השתמשנו ספריה זמינים מסחרית RNAi גנומית עם באורך מלא מוסיף cDNA. ספריה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מועמדים רבים על ידי הפחתת RNAi של המוצר הגן המועמד. שנית, אנו שנוצר transgene משולב המבטא חלבון מתויג fluorecently שלנו עניין ברקע RNAi רגיש. שלישית, על ידי חשיפת בעלי החיים בקעו כדי RNAi, מסך זה מאפשר זיהוי של מוצרים גנים שיש להם תפקיד חיוני עובריים שאחרת להסוות תפקיד שלאחר עובריים בוויסות חלבון של עניין. לבסוף, המסך הזה עושה שימוש במיקרוסקופ המתחם מצויד לפתרון תא בודד.

Protocol

1. זן הקרנת הבנייה

תכנון קפדני של זן ההקרנה היא קריטית להצלחה של המסך תוארה במקומות אחרים ^3. עבור חוקרים מסוימים, באמצעות מאמץ המבטא מוצר גלוי מ transgene דרוש הניסוי. זנים רבים מחסה transgenes משולבים זמינים לחוקרים CGC או אדם פרטי. אם זן מהונדס נדרש המסך אבל הוא לא זמין, אז זה יכול להיות שנוצר באמצעות שיטת שפורסם כמו ⁴ הפצצה, UV / tmp ^5, או מוס transposon הכנסת ^6. כדי להמחיש החלבון שלנו של עניין, הכנסנו את רצף ה-GFP קידוד במסגרת רצף cDNA בוגרת (השתמשנו dbl-1 ברצף). כי זה חלבון היתוך GFP אינו גלוי על ידי לנתח היקף, השתמשנו סמן coinjection כי היה גלוי לא השפיע על הצפייה של החלבון שלנו עניין (TTX-3P :: RFP , לבדיקה של מספר סמנים סטנדרטיים אחרים, ראה ^7). לאחר מכן יצר transgene משולב ממערך extrachromosomal. מצאנו כי ההפצצות של transgene הניבה מספר נמוך עותק קו משולב לא הציל את הפנוטיפ מיקרוסקופ לנתח ולא הפיק רמות הגלויים של מוצר ה-GFP-מתויג (Beifuss ו Gumienny, לא פורסם). UV / tmp שילוב של מערך עותק מספר extrachromosomal עשה במקור על ידי הזרקת ^8,9 הניב גלוי, הצלת רמות של המוצר transgene (איור 3 א). כתם המערבי עם נוגדן אנטי-GFP אישר כי transgene (שם אלל texIs100) באה לידי ביטוי ומעובד כראוי (Beifuss ו Gumienny, לא פורסם). Transgenes משולבים יש outcrossed חמש פעמים להסיר מוטציות רקע זרים ללא קשר למקור.

על המסך שלנו, רצינו את החלבון רק עניין להיות בצורה מהונדס, מתויג. לכן, הסרנו גרם אנדוגני תפקודיתמזרח על ידי החדרת אובדן-of-פונקציה מוטציה dbl-1 אלל.

לבסוף, אנחנו זן רגיש להשפעות של RNAi. RNAi מהספריה יהיה, כי גנים רבים, לייצר ירידה חמורה יותר אם המוצר גן חיות מכילים מוטציה מגרה את החיות להשפעות של RNAi ^10,11 רקמות (ים) של עניין יש לשקול בעת בחירת מתאים RNAi רגישות רקע ^11. השתמשנו אלל הקנונית rrf-3 (pk1426) לעשות מאמץ ההקרנה שלנו. RRF-3 הוא RNA-RNA מכוונת (RdRP) פולימראז homolog שבדרך כלל מעכב סומטי RNAi ^10. מוטציות בגנים אחרים RNAi hypersensitizing כמו ערי-1 או ערי-1-15 ב לין ניתן להשתמש במקום כדי להגביר את האפקטיביות של RNAi ^11-13.

זן ההקרנה עשינו יש גנוטיפ rrf-3 (pk1426); texIs100; dbl-1 (nk3).

2. בחירת והכנתRNAi הספריה

זמינה באופן מסחרי ג elegans ספריות cDNA מייצגים כ 55% או 87% מהגנים החזויים ב C. elegans בנפרד (וידאל במעבדה או Ahringer ספריות מעבדה, בהתאמה). שיבוטים אישיות זמינים לרכישה (פתח Biosystems, Geneservice בע"מ). בחרנו את הספרייה ORF-RNAi נבנה על ידי המעבדה וידאל (פתח Biosystems) כי שיבוטים שלה הם בעיקר באורך מלא cDNAs Gateway משובטים ומוכן יישומים במורד הזרם (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). הספרייה המקורי Ahringer במעבדה הגנטית cDNA מכיל שברי cDNA כי הם לא שימושי נרחב עבור ניסויים אפיון במורד הזרם ^14,15. ספריות הן להשתמש וקטור המכיל שני היזמים T7 משני צדי הוספה (איור 1). בונה את מגדלים זן חיידקי HT115, המבטא פולימראז T7 על ידי אינדוקציה איזופרופיל-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). חיידקים המכילים שיבוטים הספרייה המושרה עם IPTG ללייצר dsRNA (ראה שלב 3.4).

לשכפל את הספרייה עם קבלת ולהשתמש כפול עבור כל הניסויים. ספריות המקורי כפול יש לאחסן שונים -80 מעלות צלזיוס מקפיאים המחוברים להפריד בין קווי חשמל.

3. הכנת חיידקים עם ספריה שיבוטים

1. (תוך חודשיים של הניסוי) חיידקים פס מן הנבחרים הספרייה שיבוטים האכלה, כמו גם בקרות חיוביות ושליליות, על LB-carbenicillin / טטרציקלין צלחות שכותרתו (אנו גדלים 8 תרבויות בכל צלחת 100 מ"מ) דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ( > 16 שעות) (איור 1). על צלחת של 24 גם זה, אנו משתמשים שני פקדים. שליטה חיובית, BLI-4 (K04F10.4), מייצרת תלויה במינון שלאחר עובריים pheontype ^16,17. הביקורת השלילית, C06C3.5, הוא pseudogene חזה ( WormBase.org ) הגורמת אין פנוטיפים שנצפו (Beifuss ו Gumienny, לא פורסם).
2. (תוך חודשיים של הניסוי, רצוי במוקדם) הכן 24 גם צמיחה נמטודות בינוני (NGM) לוחות המכילים 25 - 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 1 מ"מ carbenicillin IPTG. לאחסן ב 4 ° C.
3. (יום 1) עבור כל שיבוט, מחסן 2 מדיה מ"ל ליברות המכילות 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​carbenicillin עם מושבה אחת מהצלחת מפוספס (ים) (בשלב 3.1), תוך שימוש בטכניקה סטרילית סטנדרטי. דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (> 16 שעות) בקבוצת שאכר אל 220-240 סל"ד (איור 1). הפתרון צריך להיות מעונן לאחר 16 שעות.
4. (יום 2) למחרת בבוקר, לגרום להכפיל גדילי RNA (dsRNA) הייצור על ידי הוספת IPTG על תרבויות לריכוז הסופי של 1 מ"מ. דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס, 220 - 240 סל"ד, במשך 4 נוסף - 5 שעות. צעד זה מבטיח עקבי ויציב יותר RNAi-Induced מציאה של המוצר גן להסתמך אך ורק על IPTG ב אגר הצלחת NGM (בשלב 3.5).
5. במקום 30 μl של כל מ"ק חיידקים המושרהlture לתוך בארות נפרדות של צלחת 24-RNAi גם NGM המכיל 25 - 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 1 מ"מ carbenicillin IPTG (איור 1, איור 4 עבור התבנית בשימוש כדי לעקוב אחר הניסויים RNAi). שים צלחות, חשף, בשכונה זרימת סטרילי במשך 20 דקות או עד הנקודות חיידקים יבשים. לא overdry. Overdrying גורם שולי אגר להתרחק מהצלחת ובעלי חיים יהיה הפיך אם הם זוחלים לתוך הסדקים וכתוצאה מכך.

4. הכנת נמטודות

התחל עם האוכלוסייה מבוימת של נמטודות. קביעת בעלי חיים מקטין את הסיכוי כי ההבדלים שנצפו בין שליטה לבין ניסויים ניסויים RNAi הם פשוט בשל הבדלים בשלב ההתפתחותי של בעלי החיים (עם זאת, אם RNAi גורם עיכוב התפתחותי, זה יש לציין ידי המסנן (איור 2)) . יתר על כן, החל את הניסוי RNAi עם הזחלים L1 מונעת תופעות מבלבלים הקטלניות האפשריות של העובר על ידי RNAi של אלוףes כי גם היא משחקת תפקיד postembryonic של עניין.

ההיערכות נעשית על ידי 1 הלבנת האוכלוסייה מעורב בשלב של זן ההקרנה, אשר רק קליפת המוגנים העוברים לשרוד. שלבים אלה בעלי חיים עד למרחק של כ 12 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס או כ -18 שעות ב 16 ° C ^18. יותר חזק חיות במה, בעלי חיים מעצר בשלב הזחל הראשונה (L1) על ידי נותן האץ' עוברים בתווך M9 בלי אוכל. חיות L1 מורעבים דגש על צמיחה קורות חיים מזון מגיל ¹⁹ החל אותו.

1. (יום 1) השתמש שלוש צלחות 100 מ"מ של הפד, נקיים זן ההקרנה חיים המכילים מבוגרים הרה להולדת ועוברים. לשטוף את בעלי החיים מהצלחות באמצעות M9 סטרילית ידי pipeting נוזלים על פני השטח את הצלחת בעדינות כדי לשחרר בעלי חיים ועוברים. מעבירים את הכביסה לתוך צינור סטרילי 15 מ"ל עם מכסה בורג.
2. אם הכביסה עולה על 3.5 מ"ל, לסובב את בעלי החיים (~ 3000 סל"ד למשך 30 שניות) ולהסיר נוזל 3.5 מ"ל. אם הכביסה הוא אניESS מ 3.5 מ"ל, מוסיפים H ₂ 0 או M9 לצינור לסך 3.5 מ"ל.
3. ללבוש ציוד מגן מתאים (חלוק, כפפות, משקפי מגן) במהלך טיפול בכימיקלים. ערבבו 0.5 מ"ל 5 N NaOH עם אקונומיקה 1 מ"ל טרי (hypochlorite נתרן 5%, פחות מ 1 שנה). להוסיף את תערובת כדי לשטוף מ"ל 3.5 נמטודות. להתחיל לספור את שעון העצר. תהליך זה לא אמור לקחת יותר מ -10 דקות. אם כן, אז עוברים יהיה בסכנה תשואה עשוי להיות מופחת, או אקונומיקה ישן וצריך להחליף.
4. המערבולת צינור במשך 10 שניות. חזור על vortexing כל שתי דקות במשך 4 עד 10 דקות. לאחר vortexing כל, לבחון את הפתרון מתחת היקף לנתח את פגרי בעלי חיים.
5. כאשר עוברים משתחררים ומבוגרים מקוטעת (6 - 8 דקות), גלולה את העוברים על ידי ספינינג צינור בצנטריפוגה הטבלה העליונה (~ 3000 סל"ד, 30 שניות).
6. Aspirate גם של supernatant ככל האפשר מבלי להפריע גלולה. תיזהר, לאחמדן.
7. הוסף M9 סטרילי אל ~ 10 מ"ל. מערבולת בקצרה תנער היטב resuspend גלולה.
8. ספין ולהסיר supernatant שוב. אם ריח של אקונומיקה ניתן להבחין בצינור, חזור על לשטוף הצורך.
9. עוברים Resuspend ב 10 - 15 מ"ל סטרילי M9 והעברה בקבוק קטן Erlenmeyer (25 מ"ל) (על אוורור). ללחוץ בטמפרטורה מתאימה זן ולהתנסות (15-25 מעלות) למשך הלילה (> 16 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס). בזמן זה, בעלי החיים לא כל הפתח מעצרו ב diapause L1.
10. (יום 2) ספין למטה L1 חיות שלב שפופרת 15 מ"ל ו resuspend ב 0.5 - 1 מ"ל M9 (~ 3000 סל"ד, 30 שניות.). מניחים 5 פתרון μL על צלחת נפרדת לספור את מספר בעלי החיים. לבצע התאמות בהיקף, במידת הצורך, כדי להניב 30 תולעים / 3 - 10 פתרונות μL.
11. לזהות כ 30 מסונכרנים hypochlorite L1 הבמה חיות על גבי החיידקים ב גם כל צלחת 24 גם מוכן. יותר מדי מומחדש מ -30 חיות לכל גם עלול לגרום לאוכלוסייה הרעבה לפני שהגיע לבגרות. תן את הצלחת יבש באלכסון העפעפיים. החלף את המכסה לאבטח אותו עם גומייה. הפוך את הצלחת ומניחים אותו בטמפרטורה המתאימה בפעם צריכה להבקיע בשלב הרצוי. בגלל rrf-3 (pk1426) הוא האלל רגישים לטמפרטורה, מתח ההקרנה שלנו בעלי החיים גדלו ב 15-17 ° C במשך שלושה עד ארבעה ימים כדי לבחון L4 לבעלי חיים בשלב מבוגרים (איור 1).

5. תצפית של נמטודות

(יום 5) לאחר נמטודות גדלו לשלב הרצוי (איור 2 א), לאשר את בקרות חיוביות ושליליות לייצר את פנוטיפים צפויים באמצעות מיקרוסקופ לנתח. אנו משתמשים BLI-4 כביקורת על יעילות RNAi, כי זה מייצר תלויה במינון שלאחר עובריים מומים נע בין מבוגרים השלפוחיות (פנוטיפ קל RNAi, לא מוצג) כדי הזחלים, נעצר מבחינה התפתחותית קטן (ה חזקה,xpected פנוטיפ RNAi) (איור 2 ב). ואז לראות את בעלי החיים בכל ניסוי גם באמצעות מיקרוסקופ לנתח ומובן מאליו הערה פנוטיפים חריגים המושרה על ידי RNAi (איור 2 ג). לאחר הפקדים אישר פנוטיפים ברוטו ציין, המסך ניסויים RNAi עבור פנוטיפים של עניין. אנו משתמשים במיקרוסקופ המתחם מצויד הקרינה ואת המטרה 63x לשמור לפחות חמישה בעלי החיים של כל ניסוי RNAi, החל בקרות (איור 3).

1. הכן את השקופית (תקן 75 x 25 מ"מ) על ידי יצירת משטח אגר 4% (אגר 4% H ₂ O). על מנת להבטיח עובי אחיד של כרית אגר, הצב שקופית זכוכית נקייה בין שני מפרידי (כל Spacer עשוי המיקרוסקופ שקופית עם שתי שכבות של סרט במעבדה על זה). פיפטה על μL 100 (שנתיים עד שלוש טיפות של pipet כוס פסטר) של אגר 4% מותכת על גבי במרכז שקופיות זכוכית נקייה. מכירה לוח אגר אגר על ידי כיסוי מותכת באמצעות שקופית נוספת להציב במהירות אך בעדינות על גבי מפרידי אתND אגר מותכת. לחשוף את משטח אגר בעדינות על ידי הזזה של שקופיות זכוכית בנפרד, לצאת משטח עמידה שקופית 1.
2. הנח ~ 5 ירידה μL של הרדמה (levamisole או אזיד הנתרן, למשל) על משטח אגר. הר 8 - 12 בעלי חיים הרדמה. מכסים 22 מ"מ x 22 # 1.5 coverslip (או את עובי coverslip מתאימה במיוחד מיקרוסקופ דריבית) ולצפות בבעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ המתחם.
3. הגן הקובע, מספר בעלי חיים שנצפו, וגם הפנוטיפ התוצאות עבור כל ניסוי RNAi. על המסך, לבצע להשתמש בתבנית רגילה (ראו למשל, איור 5).
4. בדוק את הפנוטיפ RNAi, המיוצר על ידי הפנוטיפ, עוד תיכון, אם אפשר, על ידי חזרה על הניסוי. (למשל, המסך למשל הוצגו בשימוש שינוי לוקליזציה dbl-1-GFP מתויג כמסך הראשי ואת גודל הגוף כמסך משני ^20). חיידקים יכולים לשמש מן פס זהה (מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס) עד חודשיים. פסים מבוגרים עלולים Result בצמיחה עניים בתרבויות לילה נוזליים ויש restreaked 1.
5. רצף לפחות קצה אחד של הכנס cDNA כדי לאשר הוספת תואם את התווית הספרייה (ספריית Ahringer יש לו ניתוח אמינות ביצוע, ראה http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/ ) ^21. Primers מומלצים (עבור מוסיף מהספריה או) לחשל באתרים האתר L4440-derived הכניסה וקטור האגף: 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG 3 'ו 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3 "(M13f20 פריימר).

באמצעות שיטה זו, אדם אחד יכול לצפות באופן סביר הבמה שניים עד ארבעה סטים של ניסויים מדי שבוע. למשל, בעלי חיים מבוים בימים שני ושלישי ניתן לצפות חמישי ושישי, בהתאמה, והוא יכול להיות מבוים שוב ביום שישי ושבת ליום שני ושלישי התצפית. בהתאם הפנוטיפ (ים) הוקרן כל יום, קבוצה רשאים לכלול 1 24 גם צלחת של תרכובת מיקרוscopy או יותר אם הפנוטיפ מזוהה במהירות. כך, לפחות 88 ניסויים שונים RNAi ניתן לראות בשבוע אחד, תוך בקרות חשבון חיוביות ושליליות ושיעור ההקרנה. מסך היקף לנתח יכול להתבצע במהירות רבה יותר, ללא צורך גובר חיות בשקופיות לצפייה. מספר אנשים יכולים גם להגדיל את התפוקה של המעבדה על ידי לוחות זמנים מדהימים ו / או שימוש מיקרוסקופים רבים. שיטה חלופית לגידול בעלי חיים על סרט דק של אגר והעברת פרוסת אגר המכיל חיות ישירות לשקופית לצפייה יכול לחסוך זמן. גרסה זו שימשה בהצלחה לסינון הפרעות זנבו של הזכר בהגדלה 400x ^22.

6. נציג תוצאות

דוגמאות לוקליזציה רגיל שונה של ה-GFP-מתויג dbl-1 מוצגים באיור 3. הביטוי הרגיל של ה-GFP-מתויג dbl-1 כולל הגחון חוט העצב סלולריים גופים שורה של punctae (איור 3 א). Dbl-1 אניזה נחלש קשות כאשר בעלי החיים ניזונים RNA שמונע תרגום dbl-1-mRNA (איור 3 ב). dbl-1 (RNAi) מייצרת גם בעלי חיים קטנים, המסך המשני בדוגמה זו (מידע לא מוצג). גנים המשפיעים dbl-1 לוקליזציה מזוהים בקלות על ידי RNAi באמצעות זן המיועד מסך זה (איור 3 ג).

באיור 1. ערכת מסך לזהות הרגולטורים של איתות תאיים dbl-1. חיידקים מן הספרייה האכלה גדלים בן לילה, המושרה עם IPTG ו מודגרות על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות נוספות כדי לאפשר לחיידקים לייצר RNA תקועים כפולה (dsRNA). 30 μl של התרבות חיידקי המושרה הוא הבחין בכל טוב על הצלחת 24 גם (צמיחה בינוני נמטודות) NGM המכיל 25 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 1 מ"מ carbenicillin IPTG ו להתייבש בשכונה זרימת סטרילית. אנחנו בשלב הראשון הזחלים הזחל (L1) שלב אחר לתת hypochlorite שטופלו embrYOS לבקוע בתקשורת ללא מזון, אשר גורם diapause L1 (פיתוח נעצר). כ 30 מסונכרנים הבמה חיות L1 הם מצופה על כל חיידקים המכילים גם מספריית RNAi, המאפשר מבוים חיות לחדש את הצמיחה לצרוך dsRNA נוצר על ידי חיידקים ^23. אחרי שעה 72 על 15 ° C, על תולעים בוגרות צעירות מוקרנים על הפנוטיפ גלוי. בגיל זה, גודל הגוף פגמים ניכרים ואת הקרינה הוא בהיר מביטוי texIs100 transgene.

איור 2. דוגמאות פנוטיפים לזהות לפני ההקרנה. כל התמונות של בעלי חיים בצלחת גם צולמו בהגדלה אותה באמצעות מיקרוסקופ לנתח. בעלי חיים היו צילמו כל כ 72 שעות לאחר ציפוי כמו זחלים מורעבים L1. כל התמונות קיבלו טיפול זהה. א) RNAi של הגן אשר מעניקה שום פגמים מורפולוגיים ברוטו. בעלי חיים בטבע מופיעים סוג. ב) RNאיי של BLI-4. בעלי חיים להציג פיתוח נעצר, הם זעירים לעומת בעלי החיים בלוח א 'ג) RNAi של dpy-13. בעלי חיים נמצאים בשלב דומה של התפתחות כמו בעלי החיים בלוח, אבל להציג את המורפולוגיה "גוצה" הגוף.

איור 3. דוגמאות החלבון מתויג fluorescently וכיצד RNAi של גנים ספציפיים משנה דפוס לוקליזציה. כל התמונות צולמו בהגדלה 630x עם מיקרוסקופיה דיסק מסתובב confocal, 5 שניות. חשיפה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. כל התמונות קיבלו טיפול זהה. ראשי חץ פתוחים מצביעים גופי התא. החצים מסמנים קו punctae. ראשי חץ מלאים עולה כמה GFP-מתויג מקומי aberrantly dbl-1. א) RNAi-fed pseudogene C06C3.5 ("סוג פראי"). ב) dbl-1 (RNAi) שליטה. ג) RNAi של גן הדרוש לוקליזציה רגיל של ה-GFP-מתויג dbl-1.

באיור 4. תבנית דוגמא למעקב אחר ניסויים RNAi (שיבוטים הספרייה) ב 24 גם הצלחות. תבנית זו ניתן להשתמש כדי ליצור תיעוד קבוע של הניסויים, שלא כמו סימון ישירות צלחות.

איור 5. תבנית דוגמא פנוטיפים הקלטה RNAi. להרחיב לפי הצורך.

Discussion

שיטת ההקרנה RNAi המוצג כאן מאפשר ניתוח רגיש ומהיר של מוצרי גנים הנדרשים הפנוטיפ (או המהונדס) רגיל postembryonic. הדוגמה המוצגת היא המסך של גנים המעורבים בלוקליזציה subcellular של חלבון מתויג fluorescently. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לזהות את הגנים המשפיעים על פנוטיפים postembryoni...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
NGM אגר	הצמיחה נמטודות בינוני	IPM מדעי, Inc	ניתן להכין בעקבות פרוטוקול אגר NGM 25
M9 בינוני	22 מ"מ KH 2 PO 4, 42 מ"מ Na 2 HPO 4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO 4		26
אגר אגר,	EMD כימיקלים בע"מ	1.01614.1000	2% במים צלחות NGM. 4% במים רפידות שקופיות מיקרוסקופ (החיטוי בתחילה במיקרוגל כדי להמיס לאחר מכן).
Bacto Peptone	בקטון דיקינסון - Difco CP	211677	0.25%
IPTG	המחקר מוצרים אינטרנשיונל קורפ	I56000-5.0	1 הריכוז הסופי mM
carbenicillin	המחקר מוצרים אינטרנשיונל קורפ	C46000-5.0	50 מיקרוגרם / מ"ל ​​דילול עובד
LB מרק לנוקס	בקטון דיקינסון - Difco CP	240230	20 גר '/ ליטר
טטרציקלין	סיגמא	268054	12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​דילול עובד
נתרן hypochlorite	כל מותג	בית 5% אקונומיקה	השתמש אקונומיקה טרי.
סודיום הידרוקסיד	כל מותג	CAS 1310-73-2	5 N המניות
M9 בינוני	Wormlab ספר המתכונים	http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab	26
levamisol	סיגמא	31742	100 מיקרומטר - 1 דילול עובד mM
אזיד הנתרן	פישר סיינטיפיק	S227	10 מ"מ דילול עבודה M9
24 גם צלחת	גריינר Bio-One	662160	VWR מפיץ
מיקרוסקופ שקופיות	כל מותג	75 x 25 x 1 מ"מ
כיסוי מיקרוסקופ תלושי	כל מותג	22 x 22 מ"מ No.1.5	השתמש עובי המומלץ על ידי היצרן מיקרוסקופ.
תרכובת מיקרוסקופ	Carl Zeiss, Inc	A1m	השתמש יעדים ומסננים כדי להתאים את הצרכים של הניסוי.
התקשורת משאבת	Manostat משאבת Varistaltic	קייט המודל # 72-620-000	השתמש בצינור ואת ההגדרות המתאימות למכשיר