RNAi скрининга для выявления Постэмбриональное фенотипы в С. Элеганс</em

Резюме

Мы описываем чувствительный метод для выявления постэмбрионального регуляторов экспрессии белка и локализации С. Элеганс С помощью РНК-интерференции на основе геномных экран и встроенный трансгена, что выражает функциональный, помеченный флуоресцентной белка.

Аннотация

C. Элеганс оказалась ценной моделью системы для обнаружения и функциональные характеристики многих генов и генных пути ^1. Более сложные инструменты и ресурсы для проведения исследований в этой системе, способствуют дальнейшей открытие генов с более тонким фенотип или ролей.

Здесь мы приводим обобщенный протокол мы адаптировали для выявления C. Элеганс генов постэмбрионального фенотипы интерес использование RNAi ^2. Эта процедура легко модифицируется для анализа фенотипа выбор, будь то свет или флуоресценции оптики на вскрытии или составной микроскоп. Этот протокол обследования капитализирует на физические активы организма и молекулярные инструменты C. Элеганс научное сообщество произвел. В качестве примера мы демонстрируем использование интегрированных трансгена, что выражает флуоресцентного продукта в экран RNAi, чтобы идентифицировать гены, необходимые для нормальной локализации этогоПродукт в конце стадии личинки и взрослые. Во-первых, мы использовали коммерчески доступный геномный RNAi библиотека с полной кДНК вставки. Эта библиотека обеспечивает быструю идентификацию нескольких кандидатов RNAi снижение продукт гена кандидата. Во-вторых, мы получили интегрированную трансгена, что выражает наше fluorecently меченый белок в РНК-интерференции с учетом фона. В-третьих, подвергая вылупившихся животных РНК-интерференции, этот экран позволяет идентифицировать генные продукты, которые играют жизненно важную роль эмбриональные, которые могли бы скрыть постэмбрионального роль в регуляции белков, представляющих интерес. Наконец, этот экран используется сложный микроскоп оборудован для одной резолюции клетки.

протокол

1. Строительство Скрининг деформации

Тщательной разработки скрининга штамм имеет решающее значение для успеха на экране и была описана в другом месте ^3. Для некоторых исследователей, используя штамм, который выражает видимый продукт от трансгенов необходимо для эксперимента. Многие штаммы укрывательство интегрированной трансгены можно получить CGC или отдельных исследователей. Если трансгенного штамма, необходимых для экрана, но не доступен, то он может быть создан с помощью метода опубликована как бомбардировка ⁴ UV / TMP ⁵ или Mos транспозона вставка ^6. Для того, чтобы визуализировать наши белок, мы вставили GFP-кодирующей последовательности в рамке со зрелой кДНК (мы использовали двойной-1 последовательности). Поскольку этот белок GFP слияния не видно анализируя возможности, мы использовали инжекции маркер, который был виден и не влияет на просмотр наших белок (TTX-3p :: RFP , для рассмотрения ряда других стандартных маркеров, см. п. ^7). Затем мы создали интегрированные трансгена от внехромосомными массива. Мы обнаружили, что бомбардировка трансгена дали низким числом копий интегрированной линии, ни спасены рассечения микроскоп фенотип не производится видимым уровнем GFP-меченый продукт (Beifuss и Gumienny, не опубликовано). UV / TMP интеграции нескольких копию внехромосомными массив первоначально сделаны инъекции ^8,9 дали видимый, спасая уровня продукт трансгена (рис. 3А). Вестерн-блот с анти-GFP антител подтвердил, что трансгена (аллель имя texIs100) выражается и обрабатываются правильно (Beifuss и Gumienny, не опубликовано). Комплексная трансгенов должны outcrossed пять раз, чтобы удалить посторонние мутации фон независимо от источника.

Для нашего экрана, мы хотели только белок быть трансгенными, помеченные форме. Таким образом, мы удалили функциональные эндогенные ген путем введения потерей функции двойной мутант-1 аллеля.

Наконец, мы чувствительным штаммом к действию РНК-интерференции. RNAi из библиотеки будет для многих генов, производят более серьезное снижение в геном продукт, если животных содержат мутации, которые сенсибилизирует животных к действию RNAi ^10,11 ткани (ы) проценты должны учитываться при выборе подходящего RNAi информирование фоне ^11. Мы использовали канонические аллель СБР-3 (pk1426), чтобы сделать наш скрининг напряжения. СБР-3 является РНК-направленной РНК-полимеразы (RDRP) гомологов, которые обычно подавляет соматические RNAi ^10. Мутации в других генах RNAi hypersensitizing как эри-1 или эри-1 линейно-15b может быть использована вместо того, чтобы повысить эффективность РНК-интерференции ^11-13.

Скрининг штамма мы сделали имеет генотип СБР-3 (pk1426); texIs100; DBL-1 (NK3).

2. Выбор и подготовкаRNAi библиотеки

Коммерчески доступные C. Элеганс кДНК библиотеки составляют около 55% или 87% от предсказанных генов C. Элеганс индивидуально (Vidal лаборатории или лаборатории Ahringer библиотеки, соответственно). Индивидуальные клоны доступны для покупки (Open Biosystems, Geneservice, Ltd.) Мы выбрали ORF-RNAi библиотека построена лаборатория Видал (Open Biosystems), потому что ее клоны в основном полнометражный кДНК клонировали шлюз и готова для последующих применений (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния). Оригинальный Ahringer лаборатории геномной библиотеки кДНК содержит кДНК фрагментов, которые не так широко, полезно для последующих экспериментов характеристика ^14,15. Обе библиотеки использовать вектор, который содержит два T7 промоутеров фланговые вставки (рис. 1). Конструкции выращивают в бактериального штамма HT115, который выражает T7 полимеразы по индукции изопропил-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Бактерии содержащие библиотеки клонов индуцированных ИПТГ кпроизводить дсРНК (см. шаг 3.4).

Скопируйте всю библиотеку на получение и использование дубликатов для всех экспериментов. Оригинал и дубликат библиотеки должны храниться в разных -80 ° C морозильники, которые подключены к отделить линий электропередач.

3. Подготовка бактерий библиотеки клонов

1. (В течение двух месяцев эксперимента) подряд бактерии из выбранных кормления библиотеки клонов, а также положительный и отрицательный контроль, помечены на LB-карбенициллин / тетрациклин пластин (мы растем 8 культур на 100 мм пластины) и инкубировать при температуре 37 ° C в течение ночи ( > 16 часов) (рис. 1). Для каждого 24-луночного планшета, мы используем два элемента управления. Положительный контроль, бли-4 (K04F10.4), производит дозозависимое постэмбрионального pheontype ^16,17. Отрицательный контроль, C06C3.5, это предсказал псевдоген ( WormBase.org ), который вызывает не наблюдается фенотип (Beifuss и Gumienny, не опубликовано).
2. (В течение двух месяцев эксперимента, желательно раньше) подготовить 24-а нематода Рост средний (НГО), чашки, содержащие 25 - 50 мкг / мл карбенициллин и 1mM IPTG. Хранить при температуре 4 ° C.
3. (День 1) Для каждого клона, привить 2 мл LB среды, содержащей 50 мкг / мл карбенициллин с одной колонии с прожилками плита (ы) (в шаге 3.1) с использованием стандартных стерильных. Инкубировать при температуре 37 ° С в течение ночи (> 16 часов) в шейкере до 220 - 240 оборотов в минуту (рис. 1). Решение должно быть облачно, после 16 часов.
4. (День 2) На следующее утро, вызывают двухцепочечной РНК (дсРНК) производства путем добавления ИПТГ к культурам до конечной концентрации 1 мм. Инкубируйте культур при 37 ° С, 220 - 240 оборотов в минуту, за дополнительные 4 - 5 часов. Этот шаг обеспечивает более согласованный и надежный RNAi вызванных нокдаун гена продукт, а не полагаться исключительно на IPTG в агар из NGM пластины (в шаге 3.5).
5. Пятно 30 мкл каждого индуцированного бактериальными у.е.lture в отдельных скважинах из 24-и РНК-интерференции NGM пластины, содержащей 25 - 50 мкг / мл карбенициллин и 1mM IPTG (рис. 1, см. рис 4 шаблон, используемый для отслеживания RNAi эксперименты). Положите пластины, раскрытый, в стерильных капот поток в течение 20 минут или пока бактериальных пятна сухие. Не пересушивать. Пересушивания вызывает края агар оторваться от плиты и животные будут безвозвратно, если они лезут в результате трещины.

4. Подготовка нематоды

Начните с поэтапным населения нематод. Постановка животных уменьшает вероятность того, что различия, наблюдаемые между контрольной и экспериментальных исследований RNAi просто из-за различий в стадии развития животных (однако, если RNAi вызывает задержку развития, то это должно быть отмечено заслон (рис. 2)) . Кроме того, начиная эксперимент RNAi с личинками L1 устраняет потенциальные вмешивающиеся эффект эмбриональной летальности на РНК-интерференции в поколениех годов, которые также могут играть роль постэмбрионального интерес.

Постановка осуществляется по первому отбеливания смешанной стадии населения скрининг напряжение, которое только яичной скорлупы защищенных эмбрионы выживают. Это этапы животных в течение 12 часов при 20 ° C или 18 часов при 16 ° C ^18. Для более плотно стадии животных, арест животных в первой личиночной стадии (L1), позволяя эмбрионов люк в среде M9 без пищи. Голодные животные L1 сделан на продовольствие рост резюме из той же начальной возрасте до ¹⁹ лет.

1. (День 1) Используйте три 100 мм пластин кормили, чистый отбор штамм животных, которые содержатся беременные взрослых и эмбрионов. Мыть животных из пластины, используя стерильные M9 по пипетировать жидкость по всей поверхности пластины слегка ослабить животных и эмбрионов. Передача стирки в стерильный 15 мл трубка с винтовой крышкой.
2. Если мыть больше 3,5 мл, замедления вращения животных (~ 3000 оборотов в минуту в течение 30 секунд) и удалить жидкость до 3,5 мл. Если промывка лESS чем в 3,5 мл, добавляют H ₂ 0 или M9 к трубке составит 3,5 мл.
3. Носите соответствующую защитную одежду (халат, перчатки и очки) при работе с химическими веществами. Смешать 0,5 мл 5 N NaOH 1 мл свежей хлорной извести (5% раствор гипохлорита натрия, менее 1 года). Добавить эту смесь 3,5 мл мытья нематоды. Начало таймер подсчитать. Этот процесс не должен длиться более 10 минут. Если это так, то эмбрионы будут поставлены под угрозу, и выход может быть уменьшен или отбеливатель стар и должен быть заменен.
4. Вихревые трубы в течение 10 секунд. Повторите встряхивая каждые две минуты за 4 до 10 минут. После каждого встряхивая, соблюдать решение по вскрытии возможности для туш животных.
5. Когда эмбрионы выпускаются и взрослые носят фрагментарный характер (6 - 8 минут), гранулы эмбрионов Вращая трубу в центрифуге столешницы (~ 3000 оборотов в минуту, 30 секунд).
6. Аспирируйте столько супернатант насколько это возможно без нарушения гранул. Будьте осторожны, нежадный.
7. Добавить стерильной M9 до ~ 10 мл. Кратко Vortex или взболтать для ресуспендирования гранул.
8. Спиновые и удалить супернатант снова. Если запах хлорной извести могут быть обнаружены в трубе, повторить полоскание по мере необходимости.
9. Ресуспендируйте эмбрионов в 10 - 15 мл стерильной M9 и передачи в небольшом (25 мл) колбу Эрленмейера (для вентиляции). Встряска на должном температуры деформации и эксперимент (15 - 25 ° C) в течение ночи (> 16 часов при 20 ° C). В это время животные все люк и арест в L1 диапаузы.
10. (День 2) спином вниз L1 этап животных в 15 мл трубку и ресуспендируют в 0,5 - 1 мл M9 (~ 3000 оборотов в минуту, 30 сек.). Поместите 5 мкл раствора на отдельные пластины и подсчитать количество животных. Внесите изменения в объеме, при необходимости, производить 30 червей / 3 - 10 мкл раствора.
11. Найди около 30 гипохлорита синхронизированы L1 этап животных на бактерии в каждую лунку подготовленные 24-луночного планшета. Слишком много моментовповторно чем 30 животных в хорошо может привести к населению голодающих до достижения зрелости. Пусть пластина с сухим косо крышками. Замените крышку и закрепите ее с помощью резиновой ленты. Переверните пластины и поместить его в соответствующую температуру на время, необходимое, чтобы выиграть на нужной стадии. Потому что СБР-3 (pk1426) представляет собой чувствительный к температуре аллель, наши животные отбора штамма выросла на 15 - 17 ° C в течение трех-четырех дней, чтобы наблюдать L4 для взрослых животных этапа (рис. 1).

5. Наблюдение нематоды

(День 5) После того, нематоды выросли до желаемой стадии (рис. 2A), убедитесь, что положительный и отрицательный контроль ожидаемых фенотипов с помощью рассечения микроскопом. Мы используем бли-4 в качестве контроля за эффективностью РНК-интерференции, поскольку он производит дозозависимое постэмбрионального дефекты, которые варьируются от волдырями взрослых (мягкий фенотип РНК-интерференции, не показано) для умственно арестован, крошечные личинки (сильный, электроннаяxpected RNAi фенотип) (рис. 2В). Тогда наблюдать за животными в каждой экспериментальной и использование вскрытия микроскоп и отмечают очевидный патологический фенотип индуцированных РНК-интерференции (рис. 2). После контроля подтверждают и валовой фенотипов отметил, экран RNAi эксперименты фенотипы интерес. Мы используем сложный микроскоп оснащен флуоресценции и 63x целью наблюдать не менее пяти животных из каждого эксперимента RNAi, начиная с управления (рис. 3).

1. Подготовка слайдов (стандартный 75 х 25 мм), сделав 4% агар панели (4% агара в H ₂ O). Для обеспечения равномерной толщины агарной средой, место чистое предметное стекло между двумя прокладками (каждая прокладка из предметное стекло микроскопа с двумя слоями лаборатории ленты на нем). Внесите 100 мкл (две-три капли из пипетки Пастера стекло) расплавленного 4% агар на центр чистой предметное стекло. Форма агарной средой путем покрытия расплавленный агар использованием дополнительных слайдов размещены быстро, но осторожно, в верхней части прокладкий расплавленного агара. Вынести агар площадку, осторожно передвигая стекол друг от друга, оставляя площадку придерживаясь одного слайда.
2. Поместите ~ 5 мкл капли анестетика (левамизол или азид натрия, например) на агар площадку. Горы 8 - 12 животных в анестезии. Залить 22 х 22 мм, № 1.5 покровное (или толщина покровного лучше всего подходит для соединения микроскопа) и наблюдать животных с использованием сложного микроскопа.
3. Запись генов, количество животных наблюдается, и фенотип результаты для каждого эксперимента RNAi. Для экрана, создавать и использовать стандартный шаблон (см., например, рисунок 5).
4. Убедитесь, что RNAi производства фенотип другой, вторичный фенотип, если возможно, и повторить эксперимент. (Например, на примере экран, показанный использовал изменение GFP с метками DBL-1 локализации в качестве основного экрана и размер тела, как дополнительный экран ^20). Бактерии могут быть использованы с той же полосе (хранить при температуре 4 ° С) до два месяца. Пожилые полосы может тesult в плохом росте в жидкой ночь культуры и должны быть restreaked в первую очередь.
5. Последовательность по крайней мере, один конец вставки кДНК, чтобы подтвердить, что вставка соответствует библиотеке метки (Ahringer библиотека была надежность проведенного анализа, см. http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/ ) ^21. Рекомендуемые грунтовки (для вставок из любой библиотеки) отжига на сайтах L4440 производных вектор и крыло вставки сайте: 5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3 'и 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (M13f20 грунтовка).

Используя этот метод, один человек вполне может устроить и соблюдать 3:58 серии экспериментов каждую неделю. Например, животные, поставленный на понедельник и вторник можно наблюдать в четверг и пятницу, соответственно, и может быть вновь поставлен на пятницу и субботу в понедельник и вторник наблюдения. В зависимости от фенотипа (ы) показан каждый день, набор может состоять из одного 24-луночного планшета на соединение микро-скопии или больше, если фенотип быстро идентифицированы. Таким образом, по крайней мере 88 различных экспериментов РНК-интерференции можно наблюдать в течение недели, с учетом положительного и отрицательного контроля и скорости проверки. Рассечения область экрана может быть выполнено намного быстрее, без необходимости установки животных на слайды для просмотра. Несколько человек также может увеличить пропускную способность лаборатории ошеломляющим графики и / или с использованием нескольких микроскопов. Альтернативный метод для выращивания животных на тонкую пленку агар и передачи кусочек агара, содержащего животных прямо на слайде для просмотра может сэкономить время. Этот вариант был успешно использован для скрининга мужчин аномалии хвоста на увеличение 400x ^22.

6. Представитель Результаты

Примеры нормальных и измененных локализации GFP с метками DBL-1 показаны на рисунке 3. Нормальное выражение GFP с метками DBL-1 включает в себя вентральный нервный шнур клетки органов и ряда punctae (рис. 3А). DBL-1 яс сильно ослабленной, когда животные питаются РНК, которая предотвращает DBL-1 мРНК перевода (рис. 3В). DBL-1 (RNAi) также производит мелких животных, дополнительный экран в данном примере (данные не представлены). Гены, которые влияют на DBL-1 локализации легко определить по RNAi использованием напряжения предназначены для этого экрана (рис. 3).

Рисунок 1. Экран схема для определения внеклеточных регуляторов DBL-1 сигнализации. Бактерии от кормления библиотеки выращивали в течение ночи, индуцированных с ИПТГ, и инкубировали при 37 ° С в течение дополнительных 4 часов, чтобы позволить бактерий для получения двухцепочечной РНК (дсРНК). 30 мкл индуцированного бактериальной культуры заметил одну скважину на 24-и НГО (средний рост нематоды) пластины, содержащей 25 мкг / мл карбенициллин и 1mM IPTG и дать высохнуть в стерильной капот потока. Мы этапе первой личиночной стадии (L1) личинок, позволяя гипохлорита обработанных EMBRйо люк в средствах массовой информации без пищи, которая вызывает L1 диапаузы (арестован развития). Около 30 животных синхронизирован L1 этапе высевают на каждой лунке содержащие бактерии из библиотеки РНК-интерференции, который позволяет поставил животных возобновить рост и потреблять дсРНК созданные бактерии ^23. Через 72 часа при 15 ° С, молодые взрослые черви, проверяются на видимый фенотип. В этом возрасте дефекты размером тела очевидны и флуоресценции яркий из texIs100 экспрессии трансгена.

Рисунок 2. Примеры фенотипов определить до скрининга. Все изображения животных в тарелку и были приняты в то же увеличение помощи рассечения микроскопом. Животные были отображаемого около 72 часов после того, как покрытие, как голодных личинок L1. Все изображения обрабатывались одинаково. А) RNAi гена, который не дает валового морфологические дефекты. Животные появляются дикого типа. B) RNА в бли-4. Животные отображения арестован развития, и крошечные по сравнению с животными группы А. С) РНК-интерференции в DPY-13. Животные находятся на той же стадии развития, как животные в панель, но надпись "унылый" тело морфологии.

Рисунок 3. Примеры флуоресцентно помеченный белка и РНК-интерференции как специфических генов изменяет локализации в клетке. Все снимки были сделаны при увеличении 630x с вращением диска конфокальной микроскопии, 5 сек. экспозиции. Шкала бар = 10 мкм. Все изображения обрабатывались одинаково. Открытые стрелки указывают на клеточных тел. Стрелками отмечены линии punctae. Заполненные стрелки указывают некоторые аберрантно локализованных GFP с метками DBL-1. А) RNAi кормили псевдоген C06C3.5 («дикий тип»). B) DBL-1 (RNAi) управления. C) РНК-интерференции генов, необходимых для нормальной локализации GFP с метками DBL-1.

Рисунок 4. Шаблон например для отслеживания RNAi эксперименты (библиотека клонов) в 24-луночных планшетах. Этот шаблон может быть использован для создания постоянной записи экспериментов, в отличие от непосредственно маркировки пластин.

Рисунок 5. Шаблон например для записи фенотипов RNAi. Развернуть по мере необходимости.

Обсуждение

Метод РНК-интерференции скрининга представленные здесь позволяет чувствительный и быстрый анализ генных продуктов, необходимых для нормальной (или трансгенных) постэмбрионального фенотипа. Пример приведен экран для генов, вовлеченных в субклеточные локализации флуоресцентной мече...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
NGM Агар	Нематоды среднего роста	ИПМ Научные, Inc	Может быть подготовлен NGM агар протокол 25
M9 среднего	22мм KH 2 PO 4, 42мм Na 2 HPO 4, 86 мм NaCl, 1 мМ MgSO 4		26
Агар-агар	EMD химических Инк	1.01614.1000	2% в воде NGM пластин. 4% в воде для прокладки стекло микроскопа (автоклав изначально и микроволновую печь, чтобы растопить в дальнейшем).
Bacto Пептон	Becton Dickinson - Difco CP	211677	0,25%
ИПТГ	Исследования продукции международной корпорации	I56000-5.0	1 мМ конечной концентрации
карбенициллин	Исследования продукции международной корпорации	C46000-5.0	50 мкг / мл рабочего разведения
LB бульоне Леннокс	Becton Dickinson - Difco CP	240230	20 г / л
тетрациклин	Сигма	268054	12,5 мкг / мл рабочего разведения
гипохлорита натрия	Любой бренд	5% отбеливателя	Используйте свежие отбеливателя.
едкий натр	Любая марка	CAS 1310-73-2	5 N акции
M9 среда	Wormlab рецептов	http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab	26
левамизола	Сигма	31742	100 мкм - 1 мм Рабочее разведение
азид натрия	Fisher Scientific	S227	10 мм в рабочем разведении M9
24-луночного планшета	Greiner Bio-One	662160	VWR дистрибьютора
предметные стекла	Любой бренд	75 х 25 х 1 мм
скользит микроскоп крышкой	Любой бренд	22 х 22 мм No.1.5	Используйте толщиной рекомендованные производителем микроскопа.
сложный микроскоп	Carl Zeiss, Inc	A1M	Используйте цели и фильтры, чтобы соответствовать потребностям эксперимента.
СМИ насоса	Маностатом Varistaltic насоса	Кейт модель № 72-620-000	Использование труб и настройки подходят для машин