ויזואליזציה של כלי דם Ca 2 + איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני

Summary

שיטה יעילה כדי להשיג תובנות לדמיין את האינדוקציה אוטוקריני הנגזרות ROS של האנדותל Ca2 + איתות מתואר. שיטה זו מנצלת את מדידת ROS נגזר אוטוקריני מופעלות Ca2 + לגיוס בתאי האנדותל בכלי הדם במודל שיתוף תרבות.

Abstract

סטרס חמצוני היה מעורב במספר מצבים פתולוגיים כולל נזק איסכמיה / reperfusion ועל אלח דם. הרעיון של סטרס חמצוני מתייחס היווצרות חריגה של ROS (מינים חמצן תגובתי), אשר כוללים ^• O ₂ ^-, H ₂ O _2, רדיקלים הידרוקסיל. מינים החמצן מגיב משפיע שפע של תהליכים תאיים כולל התמרה האות, התפשטות תאים ומוות התא ^1-6. ROS יש פוטנציאל נזק בכלי הדם ותאי איבר ישירות, והוא יכול ליזום תגובות כימיות משני שינויים גנטיים כי בסופו של דבר לגרום הגברה של הנזק ROS בתיווך הראשוני רקמות. רכיב מרכזי של מפל הגברה המחזקת נזק בלתי הפיך לרקמות הוא גיוס והפעלה של מחזורי תאים דלקתיים. במהלך דלקת, תאים דלקתיים לייצר ציטוקינים כגון נמק הגידול גורם-α (TNFα) ו-IL-1 כילהפעיל בתאי האנדותל (EC) ותאי אפיתל נוספת להגדיל את ⁷ התגובה הדלקתית. תפקוד אנדותל כלי דם הוא תכונה הוקמה דלקת חריפה. המקרופאגים לתרום תפקוד אנדותל במהלך דלקת על ידי המנגנונים אינם ברורים. הפעלה של תוצאות מקרופאגים לשחרור תאיים של O ₂ ^{• -} שונות הפרו ציטוקינים דלקתיים, אשר מפעילה איתות פתולוגיים בתאים סמוכים ^8. Oxidases NADPH הם המקור העיקרי והראשון במעלה של ROS ברוב סוגי התאים. לאחרונה, היא מופיעה על ידינו ואחרים ^9,10 כי ROS המיוצר על ידי oxidases NADPH לעורר את הייצור המיטוכונדריאלי ROS במהלך תנאי pathophysiological רבים. מכאן מדידת הייצור המיטוכונדריאלי ROS חשוב לא פחות בנוסף למדידת cytosolic ROS. המקרופאגים מייצרים ROS על ידי האנזים מונואמין NADPH flavoprotein אשר ממלא תפקיד העיקרי לדלקת. הופעל פעם אחת,NADPH אוקסידאז phagocytic מייצרת כמויות עצומות של O ₂ ^{• -} חשובים במנגנון ההגנה המארחת ^11,12. למרות אוטוקריני הנגזרות O ₂ ^{• -} ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של מחלות כלי הדם, ויזואליזציה של ROS-Induced אוטוקריני איתות תאיים, כולל גיוס Ca ^{2 +} עדיין השערה. פיתחנו מודל שבו מקרופאגים מופעל משמשים כמקור של O ₂ ^{• -} כדי transduce איתות לתאי אנדותל סמוכים. באמצעות מודל זה אנו מראים כי macrophage הנגזרות O ₂ ^{• -} להוביל סידן איתות לתאי אנדותל סמוכים.

Protocol

מינים חמצן תגובתי יכול להימדד בתאים חיים באמצעות צבעים חמצון רגיש (1 & 2) או באמצעות חיישני פלסמיד (3 & 4) על ידי מיקרוסקופיה confocal.

1. ויזואליזציה של cytosolic ROS ב J774 תאים

1. לגדול J774.1 מונוציטים הנגזרות עכבר מקרופאגים (10 ⁶ תאים / מ"ל) בתחתית כוס 35 מ"מ צלחות (Apparatus הרווארד) עבור 48 ח
2. אתגר תאים עם אגוניסטים TLR (2 מיקרוגרם / מ"ל, שאיבה, teichoic חומצה TLR2 אגוניסט; 10μg/ml, פולי (אני: C)-TLR3 אגוניסט: 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS-TLR4 אגוניסט) למשך 6 שעות על 37 ° C.
   הערה: המקרופאגים מטופלים בתנאים דומים שימשו שיתוף תרבות מודל Ca ^{2 +} גיוס.
3. מוסיפים את חמצון רגיש צבע H ₂ DCF-DA (Invitrogen) לתת הריכוז הסופי של 10 מיקרומטר ECM (בינוני תאיים: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO _3, 10 mM Na-HEPES, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH ₂ PO _4, 1.2 mM MgSO _4, 2 מ"מ CaCl _2, 10mM גלוקוז 2.0% dextran, pH 7.4, כל המתקבלים Sigma) המכיל BSA 2% ל מנות ותאים דגירה של 20 דקות לפני להדמיה תחת מיקרוסקופ confocal.
4. לאחר טעינת צבע, לדמיין תאים להציב על הבמה טמפרטורה מבוקרת של מערכת ההדמיה המתאימה. אנו משתמשים Carl Zeiss LSM 510 הדמיה confocal Meta המערכת יחד עם ארגון מקור לייזר יון על עירור של 488 ננומטר עבור DCF הקרינה באמצעות אובייקטיבי שמן 40X ¹³ (איור 1A ו-D).
5. ניתוח תמונות באמצעות ImageJ תוכנה (1.44), תוכנה להורדה חופשית מ-National Institutes of Health (Rasband, היה, ImageJ, ארה"ב National Institutes of Health, Bethesda, מרילנד, ארה"ב, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. ויזואליזציה של תאים mROS ב J774

1. לגדול J774.1 מונוציטים הנגזרות עכבר מקרופאגים (10 ⁶ תאים / מ"ל) בתחתית כוס 35 מ"מ צלחות (Apparatus הרווארד) עבור 48 ח
2. האתגר התאים עם ligands TLR לגרום הייצור mROS (2 מיקרוגרם / מ"ל, שאיבה, teichoic חומצה TLR2; 10μg/ml, פולי (אני: C)-TLR3: 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS-TLR4) במשך 6 שעות ב 37 מעלות ג
3. הוסף המיטוכונדריה אינדיקטור superoxide MitoSOX האדום (Invitrogen) לתת הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר ECM BSA המכיל 2% ל מנות ותאים דגירה למשך 30 דקות ב 37 מעלות על מנת לאפשר טעינה של MitoSOX האדום.
4. לאחר טעינת צבע, לדמיין תאים על במה טמפרטורה מבוקרת של קרל צייס LSM 510 לזוג Meta מערכת הדמיה confocal עם מקור ארגון לייזר יון על עירור של 561 ננומטר במשך MitoSOX האדום הקרינה באמצעות אובייקטיבי שמן 40X (איור 1B ו-E).
5. על הניסויים שליטה, לאחר טעינת צבע להוסיף PBS או DMSO (בקרה שלילית) או Antimycin 2μM (כמו המיטוכונדריה superoxide גנרטור חיובי שליטה) לתאי לפני התמונה מדגם כמתואר 2.4 (איור 1C).
6. לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ (1.44).

3. Visualizatiעל cytosolic של ROS ב MPMVECs יציב Hyper-Cyto

1. אנו משתמשים pHyPer-Cyto (Evrogen) קידוד יונקים וקטור ביטוי Hyper חיישן פלורסנט שמתאימה בציטופלסמה ובמיוחד החושים ריכוז submicromolar של H ₂ O ₂ ^14.
2. Transfect תאים Murine ריאתי אנדותל כלי הדם (MPMVECs) עם וקטור pHyPer-Cyto שימוש או electroporation או ריאגנטים transfection. אנו משתמשים בגודל 10 x 10 ⁶ תאים transfect עם 10μg של pHyPer-Cyto דרך electroporation באמצעות BioRad ג'ין pulser מערכת electroporator (250V; μF 500). MPMVECs תרבות בינוני DMEM בתוספת 10% FBS, חומצות אמינו חיוניות, תוספת צמיחה האנדותל אנטיביוטיקה.
   הערה: בעקבות transfection, תאים צלחת בצפיפות נמוכה כדי להקל על גידול המושבה.
3. החלף בינוני עם בינוני תרבות שלמה בתוספת 500 מיקרוגרם / מ"ל ​​G418, 48 שעות לאחר transfection. מסך עבור שיבוטים כי יש האחוז הגבוה ביותר של H yPer תאים חיוביים Hyper מעבר שיבוטים חיובית להגדיל את מספר התאים חיובי Hyper (איור 2).
   הערה: אנו משתמשים דילול סדרתי של תאים משובטים לבחירה של תאים בודדים מסך עבור תאים מאוד יציבה מביע Hyper.
4. לגדול יציב Hyper-Cyto MPMVECs על 0.2% coverslips מצופה ג'לטין (80 מפגש%). האתגר הבא יום תאים עם ligands TLR (2 מיקרוגרם / מ"ל, חומצה TLR2 Lipoteichoic; 10μg/ml, פולי (אני: C)-TLR3: 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS-TLR4) במשך 6 שעות ב 37 ° C. בתאים שלא טופלו לשמש מלאה.
5. לאחר הטיפול, הר coverslips על Attofluor תא תא (Invitrogen). הוסף 1ml של טרום חימם פתרון הנקס מלח מאוזנת (HBSS) לתא והמקום קאמרית על הבמה טמפרטורה מבוקרת של Carl Zeiss LSM מערכת 510 Meta הדמיה confocal. המחש הקרינה התמונה להשתנות בכל עירור של 488 ננומטר באמצעות אובייקטיבי שמן 40X (איור 3A ו-D).
6. ניתוח תמונות באמצעות ImageJ תוכנה (1.44) (ראה סעיף 6).

itle "> 4. ויזואליזציה של המיטוכונדריה ROS ב MPMVECs יציב Hyper-dMito

1. אנו משתמשים pHyPer-dMito (Evrogen) ביטוי יונקים וקטור קידוד המיטוכונדריה במיקוד Hyper שמתאימה בריכוז החושים המיטוכונדריה ובמיוחד submicromolar של H ₂ O _2.
2. MPMVECs Transfect עם pHyPer-dMito וליצור יציבה Hyper-dMito MPMVECs הבאים השלבים המתוארים בסעיף 3.2-3.3.
3. לגדול יציב Hyper-dMito MPMVECs על 0.2% coverslips מצופה ג'לטין (80 מפגש%).
4. האתגר הבא יום תאים עם ligands TLR (2 מיקרוגרם / מ"ל, חומצה TLR2 Lipoteichoic; 10μg/ml, פולי (אני: C)-TLR3: 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS-TLR4) במשך 6 שעות ב 37 ° C. בתאים שלא טופלו לשמש בקרה שלילית. הוסף Antimycin 2μM המדגם (הבקרה המיטוכונדרי inducer חיובי superoxide) לפני חזותי.
5. לאחר הטיפול, הר coverslips על Attofluor תא תא (Invitrogen). הוסף 1ml של תמיסת הנקס מראש חימם מלח מאוזנת (HBSS) לתאוהמקום קאמרית על הבמה טמפרטורה מבוקרת של Carl Zeiss מערכת LSM 510 confocal הדמיה מטה. המחש לשנות את התדמית הקרינה על עירור של 488 ננומטר באמצעות אובייקטיבי שמן 40X (איור 3B, C ו-E).
6. ניתוח תמונות באמצעות ImageJ תוכנה (1.44) (ראה סעיף 6).

5. Co-תרבות מודל הדמיה של אוטוקריני הנגזרות ROS מופעלות Ca ^{2 +} איתות לתאי אנדותל

להדמיה ומדידה של [Ca ^{2 +]} i שינויים אנו משתמשים Ca ^{2 +} צבע פלואורסצנטי רגיש fluo, 04:00 (Invitrogen).

1. לגדול MPMVECs על 0.2% coverslips מצופה זכוכית 25mm ג'לטין (80 מפגש%).
2. דגירה התאים גדל על coverslips בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ב ECM BSA המכיל 2% חומצה pluronic 0.003% עם 5 מיקרומטר fluo, 04:00 (Invitrogen) הריכוז הסופי כדי לאפשר טעינה של fluo, 04:00. לאחר הטעינה, לשטוף תאים עם פתרון הדמיה ניסיוני (ECM המכיל 0.25% BSA) המכיל sulfinpyrazone כדי להקטין את איבוד הצבע.
3. לאחר טעינת fluo-4, הר coverslips על Attofluor תא תא (Invitrogen). הוסף 800μl מראש חימם פתרון הדמיה ניסיוני לתא והנח אותו על הבמה טמפרטורה מבוקרת של Carl Zeiss מערכת LSM 510 confocal הדמיה מטה.
4. בתווית צינור להפריד את מקרופאגים nonactivated או מופעל מבודד או wild-type או gp91 ^{phox-/ -} עכברים (LPS שטופלו במשך 6 שעות) עם תא גשש אדום CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) ב ECM BSA המכיל 2% ו pluronic 0.003% חומצה. לשטוף ו resuspend תאים עם 200μl של פתרון הדמיה ניסיוני.
5. הוסף מקרופאגים שכותרתו על fluo, 04:00 טעון MPMVECs באסיפה קאמרית.
6. הקלט את פלואורסצנטי ירוק ואדום כל -3 דקות 10-20 באמצעות Carl Zeiss LSM510 Meta מערכת הדמיה confocal עם מקור ארגון לייזר יון עם עירור ב 488 ו 561 nm עבור fluo, 04:00 ותא גשש אדום פלואורסצנטי respectively (Fig.4 AC).
   הערה: לחילופין, J774.1 קו התא יכול לשמש כדי לעורר MPMVECs Ca ^{2 +} גיוס.
7. ניתוח fluo-4 שינויים בעוצמת הקרינה באמצעות ImageJ תוכנה (1.44) (ראה סעיף 6).

6. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה ImageJ

העברת התמונות המתקבלות במערכת confocal כקובץ. LSM פורמט לניתוח נתונים. ZEN ZEN 2009 ו 2010 בתוכנה המסופקת עם מיקרוסקופ 510 Meta LSM LSM confocal או 710 מיקרוסקופ multiphoton confocal בהתאמה שומר קבצים בפורמט. LSM. אנו ממליצים להשתמש זה הילידים. LSM לניתוח קבצי תמונה כמו באיכות המקורית נשמרת. פורמט קובץ זה ניתן לפתוח ישירות ניתוח התמונה תמונה ג'תוכנית השלבים הבאים לספק דוגמה ניתוח כמותי של תמונה בודדת. תוספים נוספים לא נדרשות לניתוח נתונים זה.

1. LSM פתח. או. TIFF הקובץ בתוכנית J תמונה באמצעות קובץ> פתח
2. לחץ על התמונה הכרטיסייה> COלורביר> ערוצים לפצל לפצל את ערוצי ירוק DIC. השתמש תמונה מערוץ ירוק לניתוח שלאחר מכן.
3. לחץ לחיצה כפולה ובחר את "מברשת אליפטית בחירה" הכרטיסייה ולהגדיר את הערך פיקסל 20.
4. עבור Hyper-Cyto תמונות, לחץ על תא אחד כדי להגדיר את האזור מעגלי המדידה. לאחר מכן לחצו על "M" מפתח כדי למדוד את העוצמה של האזור הנבחר. הערכים נשמרים בחלון התוצאות החדשות.
5. הבא על ידי החזקת "Shift" לחץ על מקש תא אחר כדי לבחור אזור אחר, ולאחר מכן על ידי לחיצה על "M" המפתח. עוצמת נרשם חלון התוצאה. חזור על השלבים 4-5 על 50 תאים שונים.
6. לקבלת תמונות Hyper d-מיטו, להגדיר את הערך פיקסל עד 10 בבחירת מברשת אליפטית. אזור של עניין (ROI) יש לעקוב באופן ידני כולל במיטוכונדריה של תאים מסוימים.
7. שימוש חופשי, לאתר את האזור סביב המיטוכונדריה ולאחר מכן הקש "M". חזור על השלבים 6-7 על 50 תאים שונים.
8. העתק את לי ערכים מחלון התוצאות ולהדביק בגיליון Excel או כל תוכנה לעלילה את התוצאות. אנו משתמשים גם SigmaPlot או PRISM Graphpad להתוות את הנתונים בתרשים.

7. נציג תוצאות

איור 1 מציג cytosolic ואת המיטוכונדריה ייצור ROS על האתגר עם ligands TLR. תמונות confocal נציג להראות גידול של DCF (cytosolic) ו MitoSOX האדום (מיטוכונדריה) פלואורסצנציה לאחר 6 שעות של גירוי. שינויים הקרינה היו מנורמל והביע כשינוי לקפל.

תרשים 2 מציג את הדור של יציבה Hyper-Cyto ו Hyper-dMito לתאי אנדותל. עכבר לתאי אנדותל היו transfected עם pHyPer-Cyto או pHyPer-dMito בונה פלסמיד דרך electroporation. תאים פלסמידים ביציבות לבטא נבחרו G418 במשך שבועיים. לאחר הבחירה, התאים היו זורעים מדולל ב 96 צלחות היטב. מושבות בודדים היו מבודדים הדמיה לביטוי הומוגני.

"e_content> איור 3 מציג את המדידה של האנדותל cytosolic ואת המיטוכונדריה H ₂ O ₂ רמות. תמונות confocal נציג להראות גידול של Hyper-Cyto (cytosolic) ו - Hyper-dMito (מיטוכונדריה) פלואורסצנציה לאחר 6 שעות של גירוי. לשינויים בעוצמת הקרינה היו מנורמל והביע כשינוי לקפל.

איור 4 מראה את ההערכה של macrophage הנגזרות ROS המושרה אנדותל cytosolic Ca ^{2 +} גיוס. LPS-גירוי מקרופאגים נוספו על ריאתי לתאי אנדותל כלי הדם (PMVEC) שהיה טעון קודם לכן עם תאיים Ca ^{2 +} ([Ca ^{2 +]} i) אינדיקטור צבע Fluo-4. יישום של LPS-הופעל מקרופאגים בר סוג עוררו [Ca ^{2 +]} i עלייה PMVECs זה היה נחלש בנוקאאוט של מונואמין NADPH תפקודית (gp91 ^{phox-/ -).}

באיור 1. Visualizatiעל של macrophage שנוצר הסלולר ROS ו superoxide המיטוכונדריה. J774.1 התאים היו תיגר עם ligands TLR2, 3 ו - 4 (2 מיקרוגרם / מ"ל, חומצה TLR2 Lipoteichoic; 10μg/ml, פולי (אני: C)-TLR3: 1 מיקרוגרם / מ"ל LPS-TLR4). עבור 6 שעות בבית 37 ° C. לאחר הטיפול התאים עמוסות (א) הסלולר ROS אינדיקטור (H ₂ DCF-DA: ירוק פלואורסצנטי) או (ב) אינדיקטור superoxide המיטוכונדריה (MitoSOX האדום, אדום פלואורסצנטי). (ג) Antimycin שימשה כביקורת חיובית עבור ייצור ROS המיטוכונדריה. שינויים בעוצמת הקרינה נבדקו בעזרת מיקרוסקופיה confocal. (ד) ו - (ה) quantitation השינוי פלואורסצנציה מתכוון.

באיור 2. ייצוג סכמטי של יצירת ביטוי יציב של cytosolic תא האנדותל המיטוכונדריה אינדיקטורים ROS.

באיור 3. V. isualization של האנדותל cytosolic ואת המיטוכונדריה H ₂ O ₂ רמות MPMVECs ביציבות להביע (א) Hyper-Cyto או (ב) Hyper-dMito הותקפת עם ligands TLR2, 3 ו - 4 (2 מיקרוגרם / מ"ל, חומצה TLR2 Lipoteichoic; 10μg / מ"ל, פולי (אני: C)-TLR3: 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​LPS-TLR4) במשך 6 שעות ב 37 ° C. (ג) Antimycin שימשה כביקורת חיובית עבור ייצור ROS המיטוכונדריה. לאחר הטיפול, שינויים בעוצמת הקרינה נבדקו בעזרת מיקרוסקופיה confocal. (ד) ו - (ה) quantitation השינוי פלואורסצנציה מתכוון.

איור 4. Macrophage הנגזרות ROS לעורר אנדותל לקוי תא Ca ^{2 +} גיוס. (א) ייצוג סכמטי של בתאי האנדותל / מחקר macrophage שיתוף תרבות מודל. (ב) מקרופאגים Murine מבודד טרי משני WT ו gp91phox עכברים null (המעבדה ג'קסון), הופעלו על ידי 1 מיקרוגרם / מ"ל LPS עבור 6 ח Macrophages תויגו עם תא גשש האדום (אדום), והוסיף על Fluo-4 PMVECs נטען (ירוק) כדי להעריך O אוטוקריני ₂ ^{• -.} איתות (C) LPS המופעל מקרופאגים מעכברים מבודד WT מופעלות גדול ומהיר Ca ^{2 +} גיוס ב PMVECs לעומת מקרופאגים מעכברים gp91phox ריק. אימות של הפעלת macrophage הוכח בעבר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השיטה המתוארת כאן מאפשר מדידה כמותית מהירה של מינים חמצן תגובתי בתאים חיים או באמצעות צבעים חמצון רגיש או חיישנים פלסמיד. אגוניסטים של TLRs (קולטני Toll-כמו) הם תרכובות לגרות את התאים דרך TLRs הנוכחי על פני התא ההדק מסלולי איתות במורד ^15. בפרוטוקול שלנו, אנו השתמשו בשלו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב	חברה	מספר קטלוגי
Attofluor תא תא	Invitrogen	A7816
Antimycin	סיגמא אולדריץ'	A8674
DMEM בינוני גלוקוז נמוכה	Invitrogen	10567-014
צמיחה האנדותל גורם תוספת (ECGS)	בצפון מדינת ניו יורק	02-102
סרום שור עוברית	Invitrogen	12662011
G418	Invitrogen	10131-027
לטין	סיגמא אולדריץ'	G1393
H 2 DCFDA	Invitrogen	D-399
LPS	סיגמא אולדריץ'	L4516
LTA	סיגמא אולדריץ'	L2515
MitoSOX האדום	Invitrogen	M36008
Opti-ממ אני מופחת בינוני סרום	Invitrogen	51985091
פן / סטרפטוקוקוס (10x)	Invitrogen	15140163
pHyPer-Cyto	Evrogen	FP941
pHyPer-dMito	Evrogen	FP942
פולי (אני: C)	סיגמא אולדריץ'	P0913
פריזמה תוכנה 5.0	GraphPad תוכנה, Inc
SigmaPlot 11.0	Systat תוכנה, Inc
טריפסין-EDTA (10x)	Invitrogen	15400054
T-25 צלוחיות	קורנינג	430639
T-75 צלוחיות	BD פלקון	353136
גם 96-TC ומיקרו צלחת יפה	BD פלקון	353072
זן 2009 תוכנה	Carl Zeiss 510 Meta confocal מיקרוסקופיה