Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

Özet

Endotel Ca2 + sinyalizasyon parakrin türetilen ROS indüksiyon görüntülenmesi anlayışlar kazanmak için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, bir ko-kültür modeli vasküler endotelyal hücreler Ca2 + seferberlik tetikleyen parakrin elde edilen ROS ölçme yararlanır.

Özet

Oksidatif stres, iskemi / reperfüzyon hasarı ve sepsis de dahil olmak üzere bir dizi patolojik durumların oluşmasında rol oynar. H ₂ O ₂ ve hidroksil radikalleri oksidatif stres kavramı O ₂ ^• ROS (reaktif oksijen türleri), anormal oluşumunu ifade eder . Reaktif oksijen türleri, sinyal iletimi, hücre proliferasyonu ve hücre ^ölümü 1-6 da dahil olmak üzere çok sayıda hücresel süreçleri etkiler. ROS doğrudan damar ve organ hücreleri hasar potansiyeline sahiptir ve sonuçta ilk ROS aracılı doku hasarının bir amplifikasyon sonucu ikincil kimyasal reaksiyonlar ve genetik değişiklikler başlatabilir. Geri dönüşümsüz doku hasarı exacerbates amplifikasyon kaskadın temel bileşeni dolaşımdaki inflamatuar hücreler işe alma ve aktivasyon. Inflamasyon sırasında, inflamatuar hücreler, tümör nekroz faktörü-α (TNF) ve IL-1 gibi sitokinler üretirendotel hücreleri (EC) ve epitel hücreleri aktif hale getirmek ve daha fazla inflamatuvar yanıt ⁷ arttırır. Vasküler endotel disfonksiyonu, akut inflamasyon kurulmuş bir özelliktir. Makrofajlar belirsizdir mekanizmaları tarafından inflamasyon sırasında endotel işlev bozukluğuna katkıda bulunur. ^{• -} komşu hücreler patolojik sinyalizasyon ⁸ tetikler ve çeşitli pro-inflamatuvar sitokinler, O ₂ ekstraselüler sürümde makrofaj aktivasyonu sonuçları. NADPH oksidaz hücre tiplerinin çoğu ROS en önemli ve birincil kaynak. Son zamanlarda, biz ve ^diğerleri 9,10 tarafından NADPH oksidaz tarafından üretilen ROS mitokondriyal ROS üretimi sırasında birçok fizyopatolojik koşullardaki neden olduğu gösterilmiştir . Bu nedenle mitokondriyal ROS üretimi sitozolik ROS ölçmek için ek olarak ölçüm eşit derecede önemlidir. Makrofajlar inflamasyon birincil rol oynar flavoprotein NADPH oksidaz enzimi tarafından ROS üretir. Bir kez aktivefagositik NADPH oksidaz bol miktarda O ₂ ^{• üretir} ana savunma mekanizması ^11,12 önemlidir. Parakrin-kökenli O ₂ ^• rağmen ^- damar hastalıkları, Ca ² de dahil olmak üzere parakrin ROS-kaynaklı hücre içi sinyal görselleştirme patogenezinde önemli ^bir rol oynar + seferberlik hala hipotezdir. ^- Biz, komşu endotel hücreleri için bir sinyal uyum sağlamak aktive _makrofajlar, O ² kaynağı • olarak kullanıldığı bir model geliştirdik. Komşu endotel hücreleri sinyal kalsiyum neden bu modeli kullanarak, makrofaj kaynaklı O ₂ ^• göstermektedir.

Protokol

Reaktif oksijen türleri, canlı hücreleri oksidasyona duyarlı boyalar (1 & 2) kullanarak veya plazmid sensörleri (3 ve 4) konfokal mikroskobi kullanarak ölçülebilir.

1. J774 hücrelerinde sitozolik ROS Görselleştirme

1. 48 saat 35 mm yemekleri (Harvard Apparatus) cam alt J774.1 fare monosit kökenli makrofajlar (10 ⁶ hücre / ml) büyütün
2. 6 saat 37 ° ° C.: TLR agonistleri (1 mcg / ml LPS-agonist TLR4; C)-TLR3 agonist 10μg/ml, Poli (2 mcg / ml, Lipo-teikoik asit-TLR2 agonist) ile meydan hücreleri
   Not: Makrofajlar benzer koşullar altında tedavi, ko-kültür modeli ^{Ca 2} + seferberlik için kullanılmıştır .
3. Oksidasyon boya H ₂ DCF-DA (Invitrogen) ECM 10 mcM bir final konsantrasyonu (Ekstrasellüler orta vermek için duyarlı: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO _3, 10 mM Na-HEPES, 4.7 mM KCl, 1.2 mM KH ekle ₂ PO _4, 1.2 mM MgSO _4, 2 mM CaCl _2, 10mM glukoz ve% 2.0 dekstran, pH 7.4 Sigma elde edilen)% 2 BSA görselleştirme konfokal mikroskobu altında 20 dakika önce yemekler ve inkübe hücreleri içeren.
4. Boya yükledikten sonra, uygun bir görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahne üzerine yerleştirilen hücrelerin görselleştirmek. DCF floresan 40x yağ hedefi ¹³ (Şekil 1A ve D) kullanarak 488 nm eksitasyon Argon iyon lazer kaynağı ile birleştiğinde, Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi kullanıyoruz.
5. ImageJ yazılımı (1.44), Ulusal Sağlık Enstitüleri (Rasband, WS, ImageJ Sağlık, Bethesda, Maryland, ABD,, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri serbestçe mevcut yazılım kullanarak görüntüleri analiz http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. J774 hücreleri mROS Görselleştirme

1. 48 saat 35 mm yemekleri (Harvard Apparatus) cam alt J774.1 fare monosit kökenli makrofajlar (10 ⁶ hücre / ml) büyütün
2. MROS üretimine neden TLR ligandları ile hücreleri Challenge (2 mcg / ml, Lipo-teikoik asit-TLR2; 10μg/ml, Poli (I: C) TLR3; 1 mcg / ml LPS-TLR4) 6 saat 37 ° C.
3. 5 mcM yemekleri ve inkübe hücreleri az 30 dakika süreyle 37 ° C izin ECM% 2 BSA içeren bir nihai konsantrasyonu vermek için mitokondriyal süperoksit göstergesi MitoSOX Kırmızı (Invitrogen) MitoSOX Red yükleniyor.
4. Boya yükledikten sonra, hücreleri MitoSOX Red floresan 40x yağlı objektif (Şekil 1B ve E) kullanarak 561 nm uyarma Argon iyon lazer kaynağı ile Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi çift bir sıcaklık kontrollü sahne gözünüzde canlandırın.
5. Kontrol deneyleri için, boya yükleme eklemek PBS veya DMSO (negatif kontrol) veya 2μM Antimycin sonra A (mitokondrial süperoksit olarak jeneratör pozitif kontrol) hücrelere örnek görüntü 2.4 (Şekil 1C) açıklandığı gibi önce.
6. ImageJ yazılımı (1.44) kullanarak görüntüleri analiz edin.

3. Visualizatiistikrarlı Hyper-sito MPMVECs sitozolik ROS

1. Biz pHyPer-sito (Evrogen) bir memeli ifade vektör kodlama sitoplazma ve H ₂ O ₂ ¹⁴ özel duyular submicromolar konsantrasyon lokalize bir floresan sensörü Hyper kullanın.
2. PHyPer-sito elektroporasyon veya transfeksiyon reaktifler kullanarak vektör ile Transfect murin Pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (MPMVECs). Biz BioRad Gene üreteci Elektroporatör sistemi 250V) (500 μF kullanarak elektroporasyon ile pHyPer-sito 10μg ile 10 x 10 ⁶ hücre ve transfect kullanın. DMEM orta Kültür MPMVECs% 10 FBS, aminoasitlerin, endotelyal büyüme ek ve antibiyotikler ile desteklenmiş.
   Not: Aşağıda transfeksiyon, koloni gelişimini kolaylaştırmak için düşük yoğunluklu plaka hücreleri.
3. 500 mg / ml G418, 48 saat sonra transfeksiyon ile desteklenmiş tam bir kültür ortamı ile birlikte, orta değiştirin. H en yüksek yüzdeye sahip klonlar için Ekran yPer pozitif hücreler ve Hyper pozitif hücreler (Şekil 2) sayısını artırmak geçiş Hyper olumlu klonlar.
   Not: Biz, son derece Hyper ifade stabil hücreleri için tek hücre ve ekran klonal seçimi için hücreler seri seyreltme kullanın.
4. % 0.2 jelatin kaplı lamelleri (80% izdiham) istikrarlı Hyper-sito MPMVECs büyütün. 6 saat 37 ° ° C: TLR ligandları (1 mcg / ml LPS-TLR4; C)-TLR3 10μg/ml, Poli (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2) Sonraki gün meydan hücreleri Tedavi edilmeyen hücrelerin kontrol olarak hizmet vermektedir.
5. Tedaviden sonra, lamelleri Attofluor hücre odası (Invitrogen) üzerine monte edin. Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) odaya ısındı ön 1ml ekle ve Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahnede odasına yerleştirin. Görselleştirin ve 40x yağlı objektif (Şekil 3A ve D) kullanılarak 488 nm eksitasyon görüntü floresan değişimi.
6. ImageJ yazılımı (1.44) (bkz. Bölüm 6) kullanarak görüntüleri analiz edin.

istikrarlı Hyper-dMito MPMVECs mitokondriyal ROS itle "> 4 Görselleştirme

1. Biz pHyPer dMito (Evrogen) H ₂ O _2, özellikle mitokondri ve duyuları submicromolar konsantrasyon lokalize bir memeli ifade vektör kodlama mitokondri hedefli Hyper kullanın.
2. Transfect pHyPer-dMito MPMVECs ve istikrarlı Hyper-dMito MPMVECs bölümünde 3,2-3,3 açıklanan adımları izleyerek oluşturur.
3. % 0.2 jelatin kaplı lamelleri (80% izdiham) istikrarlı Hyper-dMito MPMVECs büyütün.
4. 6 saat 37 ° ° C: TLR ligandları (1 mcg / ml LPS-TLR4; C)-TLR3 10μg/ml, Poli (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2) Sonraki gün meydan hücreleri Tedavi edilmeyen hücreler negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. 2μM Antimycin A (mitokondrial süperoksit indükleyicisi pozitif kontrol) görselleştirmek için önce örnek ekleyin.
5. Tedaviden sonra, lamelleri Attofluor hücre odası (Invitrogen) üzerine monte edin. Odasına önceden ısıtılmış Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 1ml ekleve Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahnede odasına koyun. Görselleştirin ve 40x yağlı objektif (Şekil 3B, C ve E) kullanarak 488 nm eksitasyon görüntü floresan değişimi.
6. ImageJ yazılımı (1.44) (bkz. Bölüm 6) kullanarak görüntüleri analiz edin.

5. Co-kültür modeli ⁺ Ca ² tetiklenen parakrin türetilen ROS görünüm için endotel hücreleri sinyal

Görselleştirme ve ölçümü için [Ca ^{2 +]} i Ca ^{2 +} hassas floresan boya fluo 04:00 (Invitrogen).

1. % 0.2 jelatin kaplı 25mm cam lamelleri (80% izdiham) MPMVECs büyütün.
2. PM fluo-4 yükleme izin ECM 5 mcM fluo 04:00 (Invitrogen) son konsantrasyon ile,% 2 BSA ve% 0.003 pluronic asit içeren 30 dakika oda sıcaklığında lamelleri yetiştirilen hücreler inkübe edin. Yükledikten sonra, (ECM 0 içeren hücreler deneysel görüntüleme çözümü ile yıkayın.Sülfinpirazon içeren boya kaybı en aza indirmek için% 25 BSA).
3. Fluo-4, montaj lamelleri Attofluor hücre odası (Invitrogen) üzerine yerleştirdikten sonra. Odaya deneysel görüntüleme çözümü ısındı öncesi 800μl ekleyin ve Carl Zeiss LSM 510 Meta konfokal görüntüleme sistemi, sıcaklık kontrollü bir sahne üzerine yerleştirin.
4. % 2 BSA içeren ECM hücre tracker kırmızı CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) ile (6 saat LPS ile tedavi) farelerde ^- ayrı bir tüp etiket nonactivated veya aktive makrofajlar yabani tip ya da ^{gp91 phox} / veya izole ve% 0.003 pluronic asit. Deneysel görüntüleme çözümü 200μl hücreleri yıkayın ve tekrar süspansiyon.
5. Oda montaj fluo-4 yüklü PM MPMVECs etiketli makrofajlar ekleyin.
6. Fluo-04:00 ve hücre tracker kırmızı floresan respectivel için 488 ve 561 nm dalga boyunda eksitasyon ile Argon iyon lazer kaynağı ile Carl Zeiss LSM510 Meta konfokal görüntüleme sistemi kullanılarak 10-20 dakika süreyle yeşil ve kırmızı floresan her 3s kaydediny (Şekil 4 AC).
   Not: Alternatif olarak, J774.1 hücre hattı MPMVECs Ca ^{2 +} seferberlik ortaya çıkarmak için kullanılan olabilir.
7. Analiz fluo-4 ImageJ yazılımı (1.44) (bkz. Bölüm 6) kullanılarak floresans yoğunluğunu değiştirir.

6. Veri analizi ImageJ yazılımını kullanarak

Konfokal sistem veri analizi. Lsm dosya biçimi olarak elde edilen görüntü aktarma. ZEN 2009 ve ZEN 2010 yazılımı LSM 510 Meta konfokal mikroskop veya LSM ile sağlanan 710 multiphoton konfokal mikroskop sırasıyla. Lsm formatındaki dosyaları kaydeder. Bu yerli kullanmanızı öneririz. Lsm dosyaları görüntü analizi için orijinal kalitesi korunur. Bu dosya biçimi, doğrudan aşağıdaki adımları bir örnek tek bir görüntü kantitatif analiz, görüntü analiz programı Resim J. açılabilir. Hiçbir ek eklentileri bu veri analizi için gereklidir.

1. Dosya> Aç kullanarak J programında açın. Lsm veya TIFF dosyası
2. Sekmesini tıklayın IMAGE> COLOR> SPLIT KANALLAR ve yeşil ve DIC kanallar ayrıldı. Sonraki analiz için yeşil kanal görüntüyü kullanın.
3. Çift tıklayın ve 'Eliptik fırça seçimi "sekmesini seçin ve 20 piksel değeri ayarlayın.
4. Hyper-sito görüntüler için, dairesel ölçüm alanını tanımlamak için tek bir hücre tıklatın. Daha sonra seçilen alanın yoğunluğunu ölçmek için "M" tuşuna basın. Değerleri, yeni bir sonuç penceresinde korunur.
5. Sonraki "M" tuşuna basarak ve ardından başka bir alan, farklı bir hücre seçmek için "Shift" tuşuna tıklayın tutarak. Şiddeti sonucu penceresinde kaydedilir. 50 farklı hücreler 4-5 adımları tekrarlayın.
6. Hiper d-mito görüntüler için, Oval fırça seçimi 10 piksel değeri ayarlayın. Ilgi Bölgesi (ROI), özellikle hücrelerin mitokondri de dahil olmak üzere elle izlenebilir.
7. "M" tuşuna basın, daha sonra mitokondri ve çevresinde freehand kullanarak, bölgede iz. 50 farklı hücreler 6-7 adımları tekrarlayın.
8. Bana kopyalayın sonuç penceresinde bir Excel sayfasına veya arsa için herhangi bir yazılım ve yapıştırma bir değer. Biz, grafik gibi verileri çizmek için SigmaPlot veya GraphPad Prism kullanır.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 TLR ligandları ile mücadele üzerine sitozolik ve mitokondriyal ROS üretimi gösterir. Temsilci konfokal görüntüleri DCF (sitozolik) ve MitoSOX Kırmızı (mitokondri) floresan stimülasyon 6 saat sonra artış göstermektedir. Floresan değişiklikler kat değiştirmek gibi normalleştirilmiş ifade edildi.

Şekil 2, istikrarlı Hyper-sito ve Hyper-dMito endotel hücreleri üretimi gösterir. Fare endotel hücreleri pHyPer-sito veya elektroporasyon yoluyla pHyPer dMito plazmid yapıları ile transfekte. Hücreler stabil bir şekilde ifade plazmid, iki hafta boyunca G418 ile seçildi. Seçimden sonra, seyreltilmiş hücreler 96 kuyucuğu ekilirler. Bireysel kolonileri izole edilmiş ve homojen bir ifade için görüntülü edildi.

e_content "> Şekil 3 endotel sitozolik ve mitokondriyal H ₂ O ₂ seviyeleri ölçümü gösterir. Temsilcisi konfokal görüntüler Hyper-sito (sitozolik) ve Hyper-dMito (mitokondri) stimülasyon 6 saat sonra floresan artış olduğunu göstermektedir. Floresans şiddeti normalize edildi ve kat değişikliği olarak ifade edilmiştir.

Şekil 4 türevi makrofaj-ROS bağlı endotel sitozolik Ca ^{2 +} seferberlik değerlendirme gösterir. LPS-uyarılmış makrofajların, hücre içi ^Ca 2 ile önceden yüklenmiş olan pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (PMVEC) üzerine ^{eklenmiştir +} ([Ca ² +] i) göstergesi boya Fluo-4 . Vahşi tip LPS ile aktive makrofajlar Uygulama [Ca ^{2 +]} uyarılmış i fonksiyonel NADPH oksidaz nakavt ile zayıflatılmış oldu PMVECs artış (gp91 ^{phox / -).}

Şekil 1. Visualizatimakrofaj hücresel ROS ve mitokondriyal süperoksit oluşturulur. J774.1 hücreleri TLR2, 3 ve 4 ligandları ile meydan okudu (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2; 10μg/ml, Poli (I: C) TLR3 1 mcg / ml LPS-TLR4) az 6 saat süreyle 37 ° C Tedavi hücreleri ile yüklü sonra (A) hücresel ROS göstergesi (H ₂ DCF-DA, yeşil floresan) veya (B) mitokondriyal süperoksit göstergesi (MitoSOX Kırmızı, kırmızı floresan). (C) Antimycin A, mitokondriyal ROS üretimi için bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Floresan değişiklikleri konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. (D) ve (E) ortalama floresan değişimi kantitasyonu.

Şekil 2. Endotel hücre sitozolik ve mitokondriyal ROS göstergeleri istikrarlı ifade üretme şematik.

Şekil 3. Vendotel sitozolik ve mitokondriyal H ₂ O ₂ seviyeleri isualization stably (A) Hyper-sito ifade MPMVECs veya (B) Hyper-dMito TLR2, 3 ve 4 ligandlar (2 mcg / ml, Lipoteichoic asit-TLR2 meydan; 10μg / ml, Poli (I: C) TLR3; 37, 6 saat 1 mcg / ml LPS-TLR4) ° C (C) Antimycin A, mitokondriyal ROS üretimi için bir pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Tedaviden sonra, floresan değişiklikleri konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. (D) ve (E) ortalama floresan değişimi kantitasyonu.

Şekil 4. ROS bozulmuş endotel hücre Ca ^{2 +} seferberlik temin Makrofaj türetilmiştir. (A), endotel hücreleri / makrofaj ko-kültür modeli çalışma şematik gösterimi. WT ve gp91phox boş fareler (Jackson Laboratory) hem de (B) Taze izole fare makrofajlar, 6 saat boyunca 1 mg / ml LPS ile aktive Macrophages hücre tracker Red (kırmızı) ile etiketli ve parakrin O ₂ ^• değerlendirmek için Fluo-4 yüklü PMVECs (yeşil) üzerine eklenen ^- sinyalizasyon (C) WT farelerin izole LPS ile aktive makrofajlar büyük ve hızlı Ca ^{2 +} seferberlik tetikleyen PMVECs içinde makrofajlar gp91phox boş farelere kıyasla. Makrofaj aktivasyon Doğrulama daha önce kanıtlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada anlatılan yöntem hücreli canlılar ya oksidasyona hassas boyalar veya plazmid sensörleri kullanarak reaktif oksijen türlerinin hızlı ve kantitatif ölçüm sağlar. TLR agonistleri (Toll-benzeri reseptörler), hücre yüzeyinde bulunan TLR aracılığıyla hücrelerini uyarmak ve downstream sinyal ^yollar 15 tetikleyebilir bileşiklerdir . Protokolde, biz üç farklı TLR agonistleri yani, Lipo-teikoik asit-TLR2 agonist; Poli (I: C). TLR3 agonist; ROS ölçüm göstermek için bir model sistem ol...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif	Şirket	Katalog numarası
Attofluor hücre bölmesi	Invitrogen	A7816
Antimycin A	Sigma Aldrich	A8674
DMEM düşük glukoz orta	Invitrogen	10567-014
Endotelyal büyüme faktörü takviyesi (EKG)	Taşradaki	02-102
Fetal sığır serumu	Invitrogen	12662011
G418	Invitrogen	10131-027
Jelâtin	Sigma Aldrich	G1393
H 2 DCFDA	Invitrogen	D-399
LPS	Sigma Aldrich	L4516
LTA	Sigma Aldrich	L2515
MitoSOX Kırmızı	Invitrogen	M36008
Opti-MEM İndirgenmiş Serum Orta	Invitrogen	51985091
Pen / Strep (10x)	Invitrogen	15140163
pHyPer-sito	Evrogen	FP941
pHyPer-dMito	Evrogen	FP942
Poli (I: C)	Sigma Aldrich	P0913
Prism yazılımının 5.0	GraphPad Software, Inc.
SigmaPlot 11.0	Systat yazılımı, Inc.
Tripsin-EDTA (10x)	Invitrogen	15400054
T-25 şişeler	Corning	430639
T-75 şişeler	BD Falcon	353136
T 96-iyiC mikro iyi plaka	BD Falcon	353072
Zen 2009 yazılımı	Carl Zeiss 510 Meta konfokal mikroskopi