Visualisation des vasculaire Ca 2 + Signalisation Déclenchée par paracrine Dérivé ROS

Résumé

Une méthode efficace pour mieux comprendre en visualisant l'induction paracrine dérivés du ROS endothéliales de signalisation Ca2 + est décrite. Cette méthode prend avantage de mesurer paracrine dérivés ROS déclenché la mobilisation de Ca2 + dans les cellules endothéliales vasculaires dans un modèle de co-culture.

Résumé

Le stress oxydatif a été impliquée dans un certain nombre de conditions pathologiques, y compris une ischémie / reperfusion dommages et la septicémie. Le concept de stress oxydatif se réfère à la formation aberrante de ROS (espèces réactives de l'oxygène), qui comprennent O ₂ ^{• -,} H ₂ O _2, et les radicaux hydroxyles. Espèces d'oxygène réactif influences d'une multitude de processus cellulaires, y compris la transduction du signal, la prolifération cellulaire et ^1-6 la mort cellulaire. ROS ont le potentiel de dommages vasculaires et les cellules des organes directement, et peuvent initier des réactions chimiques secondaires et des altérations génétiques qui aboutissent à une amplification du dommage tissulaire ROS médiée initiale. Un élément clé de la cascade d'amplification qui exacerbe les dommages tissulaires irréversibles est le recrutement et l'activation de la circulation des cellules inflammatoires. Durant l'inflammation, les cellules inflammatoires produisent des cytokines comme facteur de nécrose tumorale α-(TNF) et de l'IL-1 quiactiver les cellules endothéliales (CE) et les cellules épithéliales et augmenter encore les ⁷ réponse inflammatoire. La dysfonction endothéliale vasculaire est un élément bien établi de l'inflammation aiguë. Les macrophages contribuent à la dysfonction endothéliale lors de l'inflammation par des mécanismes qui restent obscures. Activation des résultats des macrophages dans la libération extracellulaire de O ₂ ^{• -} et diverses cytokines pro-inflammatoires, ce qui déclenche la signalisation pathologique dans les cellules adjacentes ^8. NADPH oxydases sont la principale source de ROS et primaire dans la plupart des types cellulaires. Récemment, il est démontré par nous et d'autres que les ROS ^9,10 produites par NADPH oxydases induire la production mitochondriale de ROS au cours de nombreuses conditions physiopathologiques. Ainsi la mesure de la production mitochondriale de ROS est tout aussi important en plus de mesurer cytosolique ROS. Les macrophages produisent des ROS par la NADPH oxydase flavoprotéine enzyme qui joue un rôle primordial dans l'inflammation. Une fois activé,NADPH oxydase phagocytaire produit de grandes quantités d'O ₂ ^{• -} qui sont importants dans le mécanisme de défense de l'hôte ^11,12. Bien paracrine dérivés O ₂ ^{• -} joue un rôle important dans la pathogenèse des maladies vasculaires, la visualisation des paracrine ROS induite signalisation intracellulaire incluant ^mobilisation du Ca2 ⁺ est encore l'hypothèse. Nous avons développé un modèle dans lequel les macrophages activés sont utilisés comme une source d'O ₂ ^{• -} pour transduire un signal pour les cellules endothéliales adjacentes. En utilisant ce modèle, nous démontrons que les macrophages dérivés de O ₂ ^{• -} conduire à la signalisation calcique dans les cellules endothéliales adjacentes.

Protocole

Espèces réactives de l'oxygène peut être mesurée dans des cellules vivantes en utilisant des colorants d'oxydation sensibles (1 & 2) ou en utilisant des capteurs plasmide (3 & 4) par microscopie confocale.

1. Visualisation des cytosolique ROS dans les cellules J774

1. Cultivez J774.1 souris dérivées de monocytes macrophages (10 ⁶ cellules / ml) sur fond de verre de 35 mm plats (Harvard Apparatus) pendant 48 h.
2. Cellules avec des agonistes TLR Défi (2 pg / ml, Lipo-acides téchoïques TLR2 agoniste; 10μg/ml, le poly (I: C)-agoniste TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4 agoniste) pendant 6 h à 37 ° C.
   Remarque: Les macrophages traités dans des conditions similaires ont été utilisés pour la co-culture modèle ^mobilisation du Ca2 ^+.
3. Ajouter le colorant sensible à l'oxydation de H ₂ DCF-DA (Invitrogen) pour donner une concentration finale de 10 uM dans l'ECM (milieu extracellulaire: 121 mM de NaCl, 5 mM NaHCO _3, 10 mM de Na-HEPES, 4,7 mM de KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,2 mM MgSO _{4, 2} mM de CaCl2, 10mM de glucose et 2,0% de dextrane à pH 7,4, tous obtenus auprès de Sigma) contenant de la BSA 2% à la vaisselle et les cellules incuber pendant 20 min avant la visualisation en microscopie confocale.
4. Après le chargement de teinture, de visualiser les cellules placées sur une scène à température contrôlée d'un système d'imagerie appropriée. Nous utilisons Carl Zeiss LSM 510 META système d'imagerie confocale couplée à laser à ions argon source à une excitation de 488 nm pour DCF fluorescence à l'aide d'huile objectif 40x ¹³ (fig. 1A et D).
5. Analyser des images en utilisant le logiciel ImageJ (1,44), un logiciel disponible gratuitement sur ​​le National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, américain National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Etats-Unis, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. Visualisation du MROS en cellules J774

1. Cultivez J774.1 souris dérivées de monocytes macrophages (10 ⁶ cellules / ml) sur fond de verre de 35 mm plats (Harvard Apparatus) pendant 48 h.
2. Défi des cellules avec des ligands de TLR pour induire la production MROS (2 pg / ml, Lipo-acides téchoïques TLR2; 10μg/ml, le poly (I: C)-TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4) pendant 6 h à 37 ° C.
3. Ajouter mitochondriale superoxyde indicateur MitoSOX Rouge (Invitrogen) pour donner une concentration finale de 5 uM de l'ECM contenant de la BSA 2% à la vaisselle et les cellules incuber pendant 30 min à 37 ° C pour permettre le chargement des MitoSOX Rouge.
4. Après le chargement de teinture, de visualiser les cellules sur une scène à température contrôlée d'un objectif Carl Zeiss LSM 510 Meta quelques confocale système d'imagerie laser à ions argon avec source à une excitation de 561 nm pour MitoSOX Rouge fluorescence à l'aide d'huile objectif 40x (Fig 1B et E).
5. Pour les expériences de contrôle, après colorant de chargement Ajouter PBS ou du DMSO (témoin négatif) ou 2 pm antimycine A. (Comme la superoxyde mitochondriale générateur contrôle positif) pour les cellules avant l'image de l'échantillon tel que décrit au paragraphe 2.4 (figure 1C)
6. Analyser les images à l'aide du logiciel ImageJ (1,44).

3. Visualizatisur des ROS dans cytosolique stables Hyper-cyto MPMVECs

1. Nous utilisons Phyper-cyto (Evrogen) un codage vectoriel d'expression mammifère une sonde fluorescente Hyper qui localise dans le cytoplasme et spécifiquement la concentration sens submicromolaires de H ₂ O ₂ ^14.
2. Transfecter murin pulmonaire cellules endothéliales microvasculaires (MPMVECs) avec Phyper-cyto vecteur en utilisant soit l'électroporation ou réactifs de transfection. Nous utilisons 10 x 10 ⁶ cellules et transfection avec 10 pg d'Phyper-cyto par électroporation en utilisant BioRad Gene pulser électroporateur système (250V, 500 uF). MPMVECs culture dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS, acides aminés non essentiels, le supplément de croissance endothéliale et les antibiotiques.
   Remarque: Après la transfection, les cellules plaque à faible densité afin de faciliter la croissance de colonies.
3. Remplacer moyenne avec un milieu de culture complet supplémenté avec 500 pg / ml de G418, 48 heures après transfection. Ecran de clones qui ont plus fort pourcentage de H cellules yper positifs et le passage Hyper clones positifs pour augmenter le nombre de cellules positives Hyper (Fig. 2).
   Note: Nous utilisons une dilution en série de cellules de la sélection clonale de cellules individuelles et à l'écran pour les cellules stables exprimant fortement hyper.
4. Cultivez stables Hyper-cyto MPMVECs sur 0,2% de gélatine lamelles couché (80% de confluence). Suivant les cellules défi jours avec des ligands de TLR (2 pg / ml, acide TLR2 lipotéichoïque; 10μg/ml, le poly (I: C)-TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4) pendant 6 h à 37 ° C. Cellules non traitées servent de contrôle.
5. Après le traitement, monter les lamelles sur des cellules Attofluor chambre (Invitrogen). Ajouter 1 ml de solution de pré réchauffé saline équilibrée de Hanks (HBSS) à la chambre et le lieu de la chambre sur une scène à température contrôlée de Carl Zeiss LSM 510 Meta système d'imagerie confocale. Visualisez et changer l'image de fluorescence à une excitation de 488 nm en utilisant l'objectif 40x du pétrole (figure 3A et D).
6. Analyser des images en utilisant le logiciel ImageJ (1,44) (voir section 6).

itre "> 4. Visualisation de l'ADN mitochondrial dans le ROS stables Hyper-dMito MPMVECs

1. Nous utilisons Phyper-dMito (Evrogen) un vecteur d'expression codant pour les mitochondries des mammifères ciblée Hyper qui localise dans la concentration des mitochondries et spécifiquement sens submicromolaires de H ₂ O _2.
2. MPMVECs Transfecter avec Phyper-dMito et générer stables Hyper-dMito MPMVECs étapes suivantes décrites dans la section 3.2 à 3.3.
3. Cultivez stables Hyper-dMito MPMVECs sur 0,2% de gélatine lamelles couché (80% de confluence).
4. Suivant les cellules défi jours avec des ligands de TLR (2 pg / ml, acide TLR2 lipotéichoïque; 10μg/ml, le poly (I: C)-TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4) pendant 6 h à 37 ° C. Cellules non traitées servent de contrôle négatif. Ajouter antimycine 2 pm Un échantillon (superoxyde mitochondrial inducteur positif de contrôle) avant de visualiser.
5. Après le traitement, monter les lamelles sur des cellules Attofluor chambre (Invitrogen). Ajouter 1 ml de solution de pré-chauffé saline équilibrée de Hanks (HBSS) à la chambreet le lieu de la chambre sur une scène à température contrôlée de Carl Zeiss LSM 510 META système d'imagerie confocale. Visualiser et modifier l'image de fluorescence à une excitation de 488 nm en utilisant l'objectif 40x huile (Fig. 3B, C et E).
6. Analyser des images en utilisant le logiciel ImageJ (1,44) (voir section 6).

5. Co-culture de modèle pour la visualisation des paracrine dérivés ROS déclenché Ca ^{2 +} de signalisation dans les cellules endothéliales

Pour la visualisation et la mesure de [Ca ^{2 +]} i les changements que nous utilisons une Ca ^{2 +} sensibles colorant fluorescent fluo-quatre heures (Invitrogen).

1. Cultivez MPMVECs sur 0,2% de gélatine revêtement des lamelles de verre de 25mm (80% de confluence).
2. Incuber les cellules cultivées sur des lamelles à température ambiante pendant 30 min dans l'ECM contenant de la BSA 2% et 0,003% d'acide pluronique avec 5 uM fluo-4 AM (Invitrogen) concentration finale pour permettre le chargement de la fluo-4 AM. Après le chargement, se laver les cellules avec une solution d'imagerie expérimental (ECM contenant 0.25% BSA) contenant sulfinpyrazone pour minimiser la perte de teinture.
3. Après le chargement fluo-4, monter sur des lamelles Attofluor cellules de chambre (Invitrogen). Ajouter 800μl de la solution d'imagerie pré réchauffé expérimentale de la chambre et le placer sur une scène à température contrôlée de Carl Zeiss LSM 510 META système d'imagerie confocale.
4. Dans une étiquette du tube de séparer les macrophages non activé ou activé isolés soit de type sauvage ou de gp91 ^{phox-/ -} souris (traitées avec du LPS pendant 6 heures) avec cellule Tracker CMTPX rouge (500ng/ml) (Invitrogen) en ECM contenant 2% de BSA et l'acide pluronique 0,003%. Laver et remettre les cellules avec 200 pl de solution d'imagerie expérimental.
5. Ajouter les macrophages étiquetés à fluo-quatre heures chargées MPMVECs dans l'assemblage de chambre.
6. Enregistrer la fluorescence verte et rouge toutes les 3s pendant 10-20 min à l'aide de Carl Zeiss LSM510 Meta système d'imagerie confocale avec une source laser Argon ions avec une excitation à 488 et 561 nm pour fluo-4 AM et cellulaire Tracker fluorescence rouge respectively (Fig.4 AC).
   Note: Alternativement, J774.1 lignée cellulaire pourrait être utilisée pour provoquer MPMVECs Ca ^{2 +} de mobilisation.
7. Analyser fluo-4 changements d'intensité de fluorescence à l'aide du logiciel ImageJ (1,44) (voir section 6).

6. L'analyse des données à l'aide du logiciel ImageJ

Transférez les images obtenues par le système confocal comme un fichier de format. Lsm pour l'analyse des données. ZEN 2009 et ZEN 2010 logiciels fournis avec le microscope LSM 510 META confocale ou LSM 710 microscope confocal multiphotonique sauve respectivement les fichiers au format LSM.. Nous vous recommandons d'utiliser ce natif. Lsm pour l'analyse d'image que la qualité d'origine est conservé. Ce format de fichier peut être directement ouvert à l'image de l'image programme d'analyse de J. Les étapes suivantes fournissent un exemple d'analyse quantitative de l'image unique. Pas de plug-ins supplémentaires sont nécessaires pour cette analyse de données.

1. Ouvrir. Lsm ou. Fichier TIFF dans le programme Image J en utilisant Fichier> Ouvrir
2. Cliquez sur l'onglet Image> COCANAUX LOR> Split et diviser les canaux vert et DIC. Utiliser l'image de la voie verte pour une analyse ultérieure.
3. Double-cliquez sur et sélectionnez le «sélection elliptique pinceau" onglet et définissez la valeur du pixel à 20.
4. Pour Hyper-cyto images, cliquez sur une cellule unique pour définir la zone circulaire de la mesure. Ensuite, appuyez sur touche "M" pour mesurer l'intensité de la zone sélectionnée. Les valeurs sont conservées dans une nouvelle fenêtre de résultats.
5. Suivant en tenant cliquer la touche "Shift" sur une autre cellule pour sélectionner une autre région, puis en appuyant sur "M". L'intensité est enregistré dans la fenêtre de résultat. Répétez les étapes 4-5 sur 50 cellules différentes.
6. Pour Hyper-d mito images, réglez la valeur du pixel à 10 dans la sélection brosse elliptique. Région d'intérêt (ROI) doit être tracée manuellement, y compris les mitochondries des cellules particulières.
7. L'utilisation à main levée, trace la région de l'ordre de la mitochondrie et appuyez sur «M». Répétez les étapes 6-7 sur 50 cellules différentes.
8. Copiez le moi une des valeurs de la fenêtre de résultats et de la coller dans une feuille Excel ou tout autre logiciel pour tracer les résultats. Nous utilisons soit SigmaPlot ou GraphPad Prism pour tracer les données comme graphique.

7. Les résultats représentatifs

La figure 1 montre cytosolique et mitochondrial production de ROS lors de l'épreuve avec des ligands de TLR. Représentant des images confocale montrent une augmentation du DCF (cytosolique) et MitoSOX Rouge (mitochondries) fluorescence après 6 heures de stimulation. Changements de fluorescence ont été normalisées et exprimées en fold change.

La figure 2 montre la génération de la technologie Hyper-cyto stables et hyper-dMito cellules endothéliales. Cellules endothéliales de souris ont été transfectées avec Phyper-cyto-ou Phyper dMito constructions plasmidiques par électroporation. Plasmides cellules exprimant de façon stable ont été sélectionnées avec du G418 pendant deux semaines. Après sélection, les cellules diluées ont été ensemencées dans des plaques 96 puits. Des colonies individuelles ont été isolés et imagées de l'expression homogène.

e_content "> Figure 3 montre la mesure de l'endothélium cytosolique et mitochondrial H ₂ O ₂ niveaux. Représentant images confocales montrent l'augmentation de l'hyper-cyto (cytosolique) et Hyper-dMito (mitochondries) fluorescence après 6 heures de stimulation. modifications intensité de la fluorescence ont été normalisées et exprimé que le changement se coucher.

La figure 4 montre l'évaluation des macrophages dérivés de ROS induite endothéliales Ca cytosolique ^{2 +} de mobilisation. LPS macrophages stimulés ont été ajoutés sur les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (PMVEC) qui avait été précédemment chargé avec le Ca ^{2 +} intracellulaire ([Ca ^{2 +]} i) colorant indicateur Fluo-4. Application de type sauvage LPS-macrophages activés évoqué une [Ca ^{2 +]} i dans les PMVECs qui a été atténuée par KO de la NADPH oxydase fonctionnelle (gp91 ^{phox-/ -).}

Figure 1. Visualizatisur des macrophages généré cellulaires ROS et superoxyde mitochondriale. J774.1 cellules ont été contestées par des ligands TLR2, 3 et 4 (2 pg / ml, acide TLR2 lipotéichoïque; 10μg/ml, le poly (I: C)-TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4). Pendant 6 h à 37 ° C Après le traitement des cellules ont été chargées avec (A) ROS cellulaires indicateur (H ₂ DCF-DA; fluorescence verte) ou (B) l'indicateur superoxyde mitochondrial (MitoSOX Rouge; fluorescence rouge). (C) antimycine A a été utilisé comme contrôle positif pour la production de ROS mitochondriale. Les changements d'intensité de fluorescence ont été évalués en utilisant la microscopie confocale. (D) et (E) La quantification de l'évolution moyenne de fluorescence.

Figure 2. Représentation schématique de générer une expression stable de cytosolique des cellules endothéliales et les indicateurs mitochondriale de ROS.

Figure 3. V. isualization des endothéliales cytosolique et mitochondrial H ₂ O ₂ niveaux MPMVECs exprimant de façon stable (A) Hyper-cyto ou (B) Hyper-dMito ont été contestées par des ligands TLR2, 3 et 4 (2 pg / ml, acide TLR2 lipotéichoïque; 10 pg / ml, le poly (I: C)-TLR3; 1 pg / ml de LPS-TLR4) pendant 6 h à 37 ° C. (C) antimycine A a été utilisé comme contrôle positif pour la production de ROS mitochondriale. Après traitement, les changements d'intensité de fluorescence ont été évaluées en utilisant la microscopie confocale. (D) et (E) La quantification de l'évolution moyenne de fluorescence.

Figure 4. Macrophages dérivés de ROS susciter altération des cellules endothéliales ^mobilisation du Ca2 ^+. (A) Représentation schématique des cellules endothéliales / macrophages étude d'un modèle de co-culture. (B) fraîchement isolées macrophages murins à la fois de WT et gp91phox souris nulles (The Jackson Laboratory) ont été activés par 1 ug / ml de LPS pendant 6 h. Macrophages ont été marquées avec la cellule-tracker Red (rouge) et ajouté sur Fluo-4 PMVECs chargé (vert) pour évaluer paracrine O ₂ ^{• -.} signalisation (C) activés par LPS des macrophages isolés de souris WT déclenché importante et rapide mobilisation de Ca ^{2 +} dans PMVECs rapport à macrophages de souris nulles gp91phox. Validation de l'activation des macrophages a été démontré précédemment.

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Discussion

La méthode décrite ici permet une mesure rapide et quantitative des espèces réactives de l'oxygène dans les cellules vivantes en utilisant soit des colorants d'oxydation ou de capteurs sensibles plasmide. Les agonistes des récepteurs TLR (Toll-like receptors) sont des composés qui stimulent les cellules à travers le TLR présents sur la surface des cellules et déclencher les voies de signalisation en aval ^15. Dans notre protocole, nous avons utilisé trois différents TLR savoir agonistes, Li...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactif	Société	Numéro de catalogue
Chambre de la cellule Attofluor	Invitrogen	A7816
Antimycine A	Sigma-Aldrich	A8674
Milieu DMEM faible taux de glucose	Invitrogen	10567-014
Endothéliale complément du facteur de croissance (ECGS)	Upstate	02-102
Sérum de veau fœtal	Invitrogen	12662011
G418	Invitrogen	10131-027
Gélatine	Sigma-Aldrich	G1393
H 2 DCFDA	Invitrogen	D-399
LPS	Sigma-Aldrich	L4516
LTA	Sigma-Aldrich	L2515
MitoSOX Rouge	Invitrogen	M36008
Opti-MEM I Réduction milieu sans sérum	Invitrogen	51985091
Pen / Strep (10x)	Invitrogen	15140163
Phyper-cyto	Evrogen	FP941
Phyper-dMito	Evrogen	FP942
Poly (I: C)	Sigma-Aldrich	P0913
Prism 5.0 du logiciel	GraphPad Software, Inc
SigmaPlot 11,0	Systat Software, Inc
Trypsine-EDTA (10x)	Invitrogen	15400054
T-25 Flacons	Corning	430639
Flacons T-75	BD Falcon	353136
96-T ainsiC micro plaques à puits	BD Falcon	353072
Zen 2009 logiciels	Carl Zeiss 510 Meta microscopie confocale