혈관 CA의 시각화 2 + Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호

요약

내피 Ca2 + 신호의 paracrine 파생 ROS 유도를 시각화에 대한 통찰력을 얻기 위해 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 공동의 문화 모델에서 혈관 내피 세포의 Ca2 +의 동원을 촉발 paracrine 파생 ROS 측정을 활용합니다.

초록

산화 스트레스는 국소 빈혈 / reperfusion 손상과 패혈증을 포함한 pathologic 조건의 숫자에 연루되었습니다. , H ₂ O _2, 및 수산기 래디 칼 ^- 산화 스트레스의 개념은 O ₂ ^{• 포함} ROS의 비정상적 형성 (반응 산소 종)를 말합니다. 반응 산소 종은 신호 전달, 세포 증식 및 세포 사망을 포함하여 ^1-6 세포 프로세스의 다수에 영향을 미칩니다. ROS는 직접 혈관과 장기의 세포를 손상 가능성을 가지고 있고, 궁극적으로 초기 ROS - 인한 조직 손상의 증폭의 결과 보조 화학 반응과 유전자 변경을 시작할 수 있습니다. 돌이킬 수없는 조직의 손상을 exacerbates 증폭 캐스케이드의 핵심 구성 요소는 염증 세포를 순환의 모집 및 활성화됩니다. 염증 동안, 염증 세포는 종양 괴사 인자 - α (TNFα)와 IL - 1 것과 크린 시토킨 생산내피 세포 (EC)와 상피 세포를 활성화하고 추가로 염증 반응 ⁷ 확대. 혈관 내피 기능 장애는 급성 염증의 설립 기능입니다. Macrophages가 불분명 메커니즘에 의해 염증 동안 내피 부전에 기여한다. O _2의 세포 릴리스에 macrophages 결과의 활성화 ^{• -} 인접 세포에 pathologic 신호 ⁸ 트리거 및 다양한 프로 염증성 크린 시토킨. NADPH의 oxidases은 세포 유형의 대부분 ROS의 전공 및 기본 소스입니다. 최근에, 그것은 NADPH의 oxidases에 의해 만들어진 ROS는 많은 pathophysiological 조건 중에 mitochondrial ROS 생산을 유도 것을 우리와 다른 ^9,10에 의해 표시됩니다. 따라서 mitochondrial ROS 생산을 측정하는 것은 cytosolic ROS를 측정 이외에 똑같이 중요합니다. Macrophages는 염증에 중요한 역할을 담당 flavoprotein의 효소 NADPH 산화 효소에 의해 ROS를 생성합니다. 일단 활성화,phagocytic NADPH 산화 효소는 O ₂ ^•의 풍부한 양의 생산 ^- 호스트 방어 메커니즘 ^11,12에 중요하다는 것을. paracrine - 파생 O ₂ ^•이 있지만 ^- 혈관 질환, CA ^2를 포함하여 paracrine ROS 유도된 세포 내 신호의 시각화의 pathogenesis에 중요한 역할을 ⁺ 동원은 아직 가설이다. 인접한 내피 세포에 신호를 transduce에 ^- 우리는 활성화 macrophages는 O _2의 소스 ^• 사용되는 모델을 개발했습니다. 인접한 내피 세포에 신호 칼슘을 초래할 ^-이 모델을 사용 우리가 O ₂ ^•이 대식 세포 - 파생 보여줍니다.

프로토콜

반응 산소 종은 산화에 민감한 염료 (1 & 2)를 사용하거나 공촛점 현미경에 의해 플라스미드 센서를 (3, 4)를 사용하여 라이브 세포 측정할 수 있습니다.

1. J774 세포에서 cytosolic ROS의 시각화

1. 48 H. 35 - mm 요리 (하버드 장치) 유리 하단에 J774.1 마우스 단핵구 파생 macrophages를 (10 ⁶ 세포 / ML) 성장
2. 37 6 H에 대한 ° C. : TLR의 agonists (1 μg / ML의 LPS - TLR4 작용제,, C) TLR3 작용제 10μg/ml, 폴리 (I 2 μg / ML, Lipo - teichoic 산 - TLR2 작용제)와 도전 세포
   참고 : 유사한 조건 하에서 처리 Macrophages가 공동 문화 모델 칼슘 ^{2 +} 동원을 위해 사용되었습니다.
3. 추가 염료 H ₂ DCF - DA (Invitrogen)는 ECM 10 μm의의 최종 농도 (세포 중간주는 산화에 민감한 : 121 MM NaCl, 5 MM NaHCO _3, 10 MM 나 - HEPES, 4.7 MM KCl, 1.2 MM KH ₂ PO _4, 1.2 MM MgSO _4, 2 MM CaCl _2, 10MM의 포도당과 2.0 % dextran, 산도 7.4, 시그마에서 얻은 모든) 공촛점 현미경 아래에서 시각화하기 전에 20 분 요리와 부화 세포에 2 % BSA를 포함.
4. 염료로드 후, 적절한 이미징 시스템의 온도 제어 무대에서 배치 세포를 시각화. 우리는 40x 오일 목표 ¹³ (그림 1A와 D)을 사용하여 DCF 형광에 대한 488 nm의의 여기에 아르곤 이온 레이저 소스와 결합 칼 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 이미징 시스템을 사용합니다.
5. ImageJ 소프트웨어 (1.44), 국립 보건원에서 다운 받으시면 소프트웨어 (Rasband, WAS, ImageJ, 건강, 베데스다, 메릴랜드, 미국의 미국 국립 연구소를 사용하여 이미지 분석 http://rsb.info.nih.gov/ij를 / , 1997-2009).

2. J774 세포에 mROS의 시각화

1. 48 H. 35 - mm 요리 (하버드 장치) 유리 하단에 J774.1 마우스 단핵구 파생 macrophages를 (10 ⁶ 세포 / ML) 성장
2. mROS 생산 유발에 TLR의 리간드로 세포를 도전 (2 μg / ML, Lipo - teichoic 산 - TLR2를, 10μg/ml, 폴리 (I : C) TLR3, 1 μg / ML LPS - TLR4) 37 6 H에 대한 ° C.
3. ° C 허용 37 30 분 요리와 부화 세포에 2 % BSA를 포함하는 ECM에 5 μm의의 최종 농도를 제공 mitochondrial 초과 산화물 지표 MitoSOX 레드 (Invitrogen)를 추가 MitoSOX 레드의 로딩.
4. 염료로드 후, 40x 오일 목표 (그림의 1B와 E)를 사용 MitoSOX 레드 형광에 대한 561 nm의의 여기에 아르곤 이온 레이저 소스와 칼 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 이미징 시스템 부부의 온도 조절 무대에서 세포를 시각화.
5. 제어 실험, 염색로드 추가 PBS 또는 DMSO (대조군) 또는 2μM의 Antimycin 후 (mitochondrial 초과 산화물과 같은 발전기 - 긍정적인 제어) 세포하기 전에 이미지 샘플을 2.4 (그림 1C)에 설명된대로합니다.
6. ImageJ 소프트웨어 (1.44)를 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다.

3. Visualizati안정적인 하이퍼 cyto MPMVECs에서 cytosolic ROS의에

1. 우리는 pHyPer - cyto (Evrogen) 포유 동물 발현 벡터 인코딩 세포질 및 H ₂ O ₂ ¹⁴ 특수 감각 submicromolar 농도 localizes 형광 센서 하이퍼를 사용합니다.
2. electroporation 또는 transfection의 시약을 사용 pHyPer - cyto 벡터와 Transfect Murine 폐 내피 세포 Microvascular (MPMVECs). 우리는 BioRad 진 pulser electroporator 시스템 (; 500 μF 250V)를 사용하여 electroporation을 통해 pHyPer - cyto의 10μg 10 X 10 ⁶ 세포와 transfect을 사용합니다. DMEM 매체에서 문화 MPMVECs 10 % FBS, 불필요한 아미노산, 내피 성장 보충 및 항생제로 보충.
   참고 : 다음의 transfection, 식민지의 성장을 촉진하기 저밀도에서 플레이트 세포.
3. 500 μg / ML G418, transfection 후 48 시간과 보충 전체 문화 매체와 매체를 대체합니다. H의 높은 비율을 가지고 클론을위한 화면 yPer 긍정적인 세포와 하이퍼 긍정적인 세포 (그림 2)의 수를 증가시킬 통로 하이퍼 긍정적인 클론.
   참고 : 우리는 매우 하이퍼 표현 안정적인 세포 하나의 세포와 화면의 clonal 선택에 대한 세포의 시리얼 희석을 사용합니다.
4. 0.2 % 젤라틴 코팅 coverslips (80 % 합류)에 안정적인 하이퍼 - cyto MPMVECs을 성장. 37 6 H에 대한 ° C. : TLR의 리간드 (1 μg / ML LPS - TLR4,, C) TLR3 10μg/ml, 폴리 (I 2 μg / ML, Lipoteichoic 산성 - TLR2)와 다음날 도전 세포 치료 세포가 통제 역할을합니다.
5. 치료 후, Attofluor 셀 챔버 (Invitrogen)에 coverslips를 탑재합니다. 실로 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)을 따뜻하게 사전의 1ml를 추가하고 칼 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 이미징 시스템의 온도 제어 무대에서 챔버를 넣습니다. 시각화 및 40x 오일 목표 (그림 3A 및 D)을 사용하여 488 nm의의 여기에서 이미지 형광 변경합니다.
6. ImageJ 소프트웨어 (1.44)를 (섹션 6 참조)를 사용하여 이미지를 분석합니다.

안정적인 하이퍼 dMito MPMVECs에서 mitochondrial ROS의 itle "> 4. 시각화

1. 우리는 pHyPer - dMito (Evrogen) H ₂ O _2의 특별히 mitochondria와 감각 submicromolar 농도 localizes 포유 동물 발현 벡터 인코딩 mitochondria 타겟 하이퍼를 사용합니다.
2. Transfect의 pHyPer - dMito와 MPMVECs 및 섹션 3.2-3.3에서 설명한 단계에 따라 안정적인 하이퍼 dMito의 MPMVECs를 생성합니다.
3. 0.2 % 젤라틴 코팅 coverslips (80 % 합류)에 안정적인 하이퍼 dMito MPMVECs을 성장.
4. 37 6 H에 대한 ° C. : TLR의 리간드 (1 μg / ML LPS - TLR4,, C) TLR3 10μg/ml, 폴리 (I 2 μg / ML, Lipoteichoic 산성 - TLR2)와 다음날 도전 세포 치료 세포는 대조군 역할을합니다. 2μM Antimycin (mitochondrial 초과 산화물 유도 - 긍정적인 제어) 사전 시각화 샘플을 추가합니다.
5. 치료 후, Attofluor 셀 챔버 (Invitrogen)에 coverslips를 탑재합니다. 실로 미리 예열 행크스 균형 소금 용액 (HBSS)의 1ml 추가그리고 칼 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 이미징 시스템의 온도 제어 무대에서 챔버를 넣습니다. 시각화 및 40x 오일 목표 (그림 3B, C 및 E)을 사용하여 488 nm의의 여기에 형광 이미지를 변경할 수 있습니다.
6. ImageJ 소프트웨어 (1.44)를 (섹션 6 참조)를 사용하여 이미지를 분석합니다.

5. 칼슘 ² 실행 paracrine - 파생 ROS의 시각화를위한 공동의 문화 모델 ⁺ 내피 세포의 신호

의 시각화 및 측정을위한 [칼슘 ^{2 +]} 나는 우리가 칼슘 ^2를 사용하여 변경 ⁺ 민감한 형광 염료 fluo - 4시 (Invitrogen).

1. 0.2 % 젤라틴 코팅 25mm 유리 coverslips (80 % 합류)에 MPMVECs 성장.
2. AM fluo - 4로드 수 ECM 5 μm의 fluo - 4시 (Invitrogen) 최종 농도 2 %의 BSA와 0.003 %의 pluronic 산을 포함하는 30 분 상온에서 coverslips에서 자란 세포를 품어. 로딩 후 (ECM은 0을 포함하는 실험 이미징 솔루션 세포를 씻는다.염료 손실을 최소화하기 위해 sulfinpyrazone을 포함 25% BSA).
3. Attofluor 셀 챔버 (Invitrogen)에 fluo - 4, 마운트 coverslips로드 후에. 실로 실험 이미징 솔루션을 따뜻하게 사전의 800μl를 추가하고 칼 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 이미징 시스템의 온도 제어 스테이지에 배치하십시오.
4. 2퍼센트 BSA를 포함하는 ECM의 세포 추적기 빨간색 CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen)과 (6 HR에 대한 LPS와 치료) 쥐 ^- 별도의 튜브 레이블에서 nonactivated 또는 활성 macrophages는 야생 형 또는 gp91 ^{phox - /} 중 격리 와 0.003 %의 pluronic 산. 실험 이미징 솔루션의 200μl와 세포를 씻고 resuspend.
5. 챔버 어셈블리에 fluo - 4로드 AM MPMVECs에 표시된 macrophages를 추가합니다.
6. fluo - 4 AM 및 세포 추적 빨간색 형광 respectivel에 대한 488 및 561 nm의 여기에있는 아르곤 이온 레이저 소스와 칼 자이스 혈구 LSM510 메타 공촛점 이미징 시스템을 사용하여 10-20 분 녹색과 빨간색 형광 매일 3S로 가져다 기록Y (Fig.4 AC).
   참고 : 또는 J774.1 셀 라인 MPMVECs 칼슘 ^{2 +} 동원을 이끌어내는 데 사용될 수 있습니다.
7. 분석 fluo을 4 ImageJ 소프트웨어 (1.44)를 (섹션 6 참조)를 사용하여 형광 강도를 변경합니다.

6. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석

데이터 분석을위한. lsm 형식의 파일로 공촛점 시스템에서 얻은 이미지를 전송합니다. 선 (禅) 2009 LSM 510 메타 공촛점 현미경이나 LSM와 함께 제공되는 선 (禅) 2010 소프트웨어는 710 multiphoton 공촛점 현미경는 각각. lsm 형식의 파일을 저장합니다. 우리는이 네이티브를 사용하는 것이 좋습니다. lsm 파일을 이미지 분석을위한 원본의 품질이 유지 때문입니다. 이 파일 형식은 바로 다음 단계는 예를에게 하나의 이미지의 정량 분석​​을 제공합니다 이미지 분석 프로그램 이미지 J.에서 열 수 있습니다. 추가 플러그인이 데이터 분석을 위해 필요하지 않습니다.

1. 파일> 열기를 사용하여 이미지 J 프로그램에서 엽니다. lsm 또는. TIFF 파일
2. 탭 이미지를 클릭> COLOR> 분할 채널과 녹색 DIC 채널을 분할. 이후 분석을위한 녹색 채널에서 이미지를 사용합니다.
3. 더블 클릭하고 '타원형 브러쉬 선택 "탭을 선택하고 20 픽셀 값을 설정합니다.
4. 하이퍼 cyto 이미지 들면, 측정의 원형 영역을 정의하는 하나의 셀을 클릭합니다. 그런 다음 선택 영역의 강도를 측정하는 "M"키를 누릅니다. 값은 새로운 결과 창에서 유지됩니다.
5. "M"키를 눌러 다음 다른 영역을 선택하려면 다른 휴대폰으로 "Shift"키를 클릭 누른 다음. 강도는 결과 창에 기록됩니다. 50 다른 세포에있는 4-5 단계를 반복합니다.
6. 하이퍼 D - 미토 이미지의 타원형 브러쉬 선택에서 10 픽셀 값을 설정합니다. 관심 영역 (ROI)은 수동으로 특정 세포의 mitochondria를 포함하여 추적할 수 있습니다.
7. 프리핸드 사용의 영역을 추적 "M"을 다음 Enter 키를 누릅니다 mitochondria와 그 주변. 50 다른 세포에있는 6-7 단계를 반복합니다.
8. 나를 복사 엑셀 시트 또는 결과를 계획하는 모든 소프트웨어에 결과 창 및 붙여넣기에서 값을 표시합니다. 우리는 그래프로 데이터를 계획하는 SigmaPlot 또는 Graphpad PRISM 중 하나를 사용합니다.

7. 대표 결과

그림 1은 TLR의 리간드와 도전에 cytosolic 및 mitochondrial ROS 생산을 보여줍니다. 대표 공촛점 이미지는 DCF (cytosolic)와 MitoSOX 레드 (mitochondria) 자극 6 시간 후 형광의 증가를 보여줍니다. 형광 변경 사항은 접어 변화로 정규화 및 표현했다.

그림 2는 안정적인 하이퍼 cyto 및 하이퍼 dMito 내피 세포의 생성을 보여줍니다. 마우스 내피 세포는 pHyPer - cyto 또는 electroporation을 통해 pHyPer - dMito 플라스미드 구조와 transfected되었다. 셀 안정 표현 plasmids 두 주 동안 G418로 선택되었습니다. 선택 후, 희석 세포는 96 잘 접시에 씨앗을 품고 있었다. 개별 식민지들이 고립 및 균질 표현 몇 군데 있었다.

e_content "> 그림 3은 내피 cytosolic 및 mitochondrial H ₂ O ₂ 수준의 측정을 보여줍니다. 대표 공촛점 이미지 하이퍼 cyto (cytosolic)와 하이퍼 dMito (mitochondria) 자극 6 시간 후 형광의 증가를 표시합니다. 형광 강도 변화가 정상화되었습니다 , 접이식 변화로 표시됩니다.

그림 4는 대식 세포 - 파생 ROS 유도된 내피 cytosolic 칼슘 ^{2 +} 동원의 평가를 보여줍니다. LPS 자극 macrophages는 이전에 다음 ID로 세포내 칼슘 ^{2로드했다} 폐동맥 내피 세포 microvascular (PMVEC)에 추가되었습니다 ⁺ ([칼슘 ^{2 +]} I) 표시기 염료 Fluo - 4. 야생 유형 LPS - 활성화 macrophages의 응용 프로그램은 [칼슘 ^{2 +]} evoked 전 기능 NADPH 산화 효소의 녹아웃에 의해 감쇠되었다 PMVECs의 상승 (gp91 ^{phox - / -).}

그림 1. Visualizati대식 세포의 세포에 대한 ROS 및 mitochondrial 초과 산화물이 생성되었습니다. J774.1 세포는 TLR2, 3 및 4 리간드와 함께 도전했다 (2 μg / ML, Lipoteichoic 산성 - TLR2, 10μg/ml, 폴리 (I : C) TLR3, 1 μg / ML LPS - TLR4). 6 H에 대한 37 ° C. 치료 세포와 함께 로드된 뒤에 (A) 세포 ROS 지표 (H ₂ DCF - DA, 녹색 형광) 또는 (B) mitochondrial 초과 산화물 표시기 (MitoSOX 적색, 적색 형광). (C) Antimycin는 mitochondrial ROS 생산에 대한 긍정적인 제어로 사용되었다. 형광 강도 변경 공촛점 현미경을 사용하여 평가되었다. (D)와 의미 형광의 변화 (E) Quantitation.

그림 2. 내피 세포 cytosolic 및 mitochondrial ROS 지표의 안정적인 표현을 생성 도식 표현.

그림 3. V. 내피 cytosolic 및 mitochondrial H ₂ O ₂ 수준의 isualization은 안정 (A) 하이퍼 - cyto을 표현 MPMVECs 또는 (b) 하이퍼 dMito는 TLR2, 3 및 4 리간드 (2 μg / ML, Lipoteichoic 산성 - TLR2와 도전을했고, 10μg / ML, 폴리 (I : C) TLR3, 37 6 H 1 μg / ML LPS - TLR4) ° C. (C) Antimycin는 mitochondrial ROS 생산에 대한 긍정적인 제어로 사용되었다. 치료 후, 형광 강도 변경 공촛점 현미경을 사용하여 평가되었다. (D)와 의미 형광의 변화 (E) Quantitation.

그림 4. ROS는 장애 내피 세포 칼슘 ^{2 +} 동원을 이끌어내는 대식 세포 - 파생. (A) 내피 세포 / 세포 대식 세포의 공동 문화 모델 연구의 도식 표현. WT과 gp91phox NULL 마우스 (잭슨 연구소) 모두에서 (B) 갓 격리 murine macrophages는 6 H. 1 μg / ML LPS에 의해 활성화되었다 Macrophages가 휴대 추적기 레드 (적색)으로 표시하고 paracrine O ₂ ^• 평가하는 Fluo - 4로드 PMVECs (녹색)에 추가되었습니다 ^-. 신호를 (C) WT 생쥐로부터 격리 LPS - 활성화 macrophages는 크고 빠른 칼슘 ^{2 +} 동원을 촉발 PMVECs에 gp91phox의 NULL 마우스에서 macrophages에 비해. 대식 세포 활성의 검증는 이전에 다음 ID로 증명되었습니다.

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토론

방법은 세포를 살아있는 하나 산화에 민감한 염료 또는 플라스미드 센서를 사용하여 반응 산소 종의 신속하고 양적 측정이 가능합니다 여기에 설명했다. TLRs의 Agonists (수신자 같은 수용체)는 세포 표면에 존재하는 TLRs를 통해 세포를 자극하고 다운 스트림 신호 경로 ¹⁵ 트리거 화합물입니다. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 세 가지 다른 TLR의 agonists의 즉 사용, Lipo - teichoic 산 - TLR2 작용제,...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약	회사	카탈로그 번호
Attofluor 셀 챔버	Invitrogen	A7816
Antimycin	시그마 알드리치	A8674
DMEM 낮은 포도당 매체	Invitrogen	10567-014
내피 성장 인자의 보충 (ECGS)	북부	02-102
태아 소 혈청	Invitrogen	12662011
G418	Invitrogen	10131-027
젤라틴	시그마 알드리치	G1393
H 2 DCFDA	Invitrogen	D - 399
LPS	시그마 알드리치	L4516
LTA	시그마 알드리치	L2515
MitoSOX 레드	Invitrogen	M36008
Opti - 가상 저는 세럼 매체를 감소	Invitrogen	51985091
펜 / Strep (10X)	Invitrogen	15140163
pHyPer - cyto	Evrogen	FP941
pHyPer - dMito	Evrogen	FP942
폴리 (I : C)	시그마 알드리치	P0913
프리즘 소프트웨어 5.0	GraphPad 소프트웨어, 주식 회사
SigmaPlot 11.0	Systat 소프트웨어, 주식 회사
트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (10X)	Invitrogen	15400054
T - 25 Flasks	코닝	430,639
T - 75 Flasks	BD 팔콘	353,136
T 96 - 웰C 마이크로 잘 플레이트	BD 팔콘	353,072
선 (禅) 2009 소프트웨어	칼 자이스 혈구 510 메타 공촛점 현미경