Visualização dos Vascular Ca 2 + Sinalização Disparado por parácrina ROS Derivado

Resumo

Um método eficiente para obter insights sobre visualizando o parácrinos derivados de indução de ROS endotelial sinalização de Ca2 + é descrito. Esse método leva vantagem de medir parácrina ROS derivados provocou mobilização de Ca2 + em células endoteliais vasculares em um modelo de co-cultura.

Resumo

O estresse oxidativo tem sido implicado em uma série de condições patológicas, incluindo isquemia / reperfusão e sepse danos. O conceito de estresse oxidativo refere-se a formação aberrante de ROS (espécies reativas de oxigênio), que incluem O ₂ ^{• -,} H ₂ O _2, e radicais hidroxila. Espécies reativas de oxigênio influencia uma grande variedade de processos celulares, incluindo transdução de sinal, a proliferação celular e morte celular ^1-6. ROS têm o potencial de dano vascular e células de órgãos diretamente, e pode iniciar reações químicas secundárias e alterações genéticas que acabará por resultar em uma ampliação do dano tecidual inicial ROS-mediada. Um componente-chave da cascata de amplificação que agrava prejuízos irreversíveis é o recrutamento e ativação de células inflamatórias circulantes. Durante a inflamação, as células inflamatórias produzem citocinas como fator de necrose tumoral α (TNF) e IL-1, queativam as células endoteliais (CE) e células epiteliais e aumentar ainda mais os ⁷ resposta inflamatória. Disfunção endotelial vascular é uma característica estabelecida de inflamação aguda. Macrófagos contribuir para a disfunção endotelial durante a inflamação por mecanismos que permanecem obscuros. Ativação de macrófagos resulta na liberação extracelular de O ₂ ^{• -} e várias citocinas pró-inflamatórias, o que desencadeia a sinalização patológicos nas células adjacentes ^8. Oxidases NADPH são a principal fonte primária de ROS e na maioria dos tipos de células. Recentemente, ele é mostrado por nós e outros ^9,10 que ROS produzidos por oxidases NADPH induzir a produção de ROS mitocondrial durante muitas condições fisiopatológicas. Daí a medição da produção de ROS mitocondrial é igualmente importante, além de medir citosólica ROS. Macrófagos produzem ROS pela oxidase NADPH flavoproteína enzima que desempenha um papel fundamental na inflamação. Uma vez ativado,NADPH oxidase fagocítica produz grandes quantidades de O ₂ ^{• -} que são importantes no mecanismo de defesa hospedeiro ^11,12. Embora parácrinos derivados de O ₂ ^{• -} desempenha um papel importante na patogênese de doenças vasculares, visualização de parácrina ROS induzida pela sinalização intracelular, incluindo Ca ^{2 +} mobilização ainda é hipótese. Nós desenvolvemos um modelo em que macrófagos ativados são usados ​​como uma fonte de O ₂ ^{• -} para transdução do sinal para as células endoteliais adjacentes. Usando esse modelo, demonstramos que macrófagos derivados de O ₂ ^{• -} levar ao cálcio sinalização em células endoteliais adjacentes.

Protocolo

Espécies reativas de oxigênio pode ser medido em células vivas usando corantes de oxidação sensíveis (1 e 2) ou usando sensores de plasmídeo (3 e 4) por microscopia confocal.

1. Visualização de citosólica ROS em células J774

1. Crescer J774.1 rato macrófagos derivados de monócitos (10 ⁶ células / ml) em fundo de vidro de 35 mm pratos (Harvard Apparatus) durante 48 h.
2. Células desafio com agonistas TLR (2 mg / ml, Lipo-Teicóicos acid-agonista TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C) TLR3-agonista, 1 mg / ml LPS-agonista TLR4) por 6 horas a 37 ° C.
   Nota: Os macrófagos tratados em condições semelhantes foram utilizados para co-cultura modelo de Ca ^{2 +} mobilização.
3. Adicione o corante de oxidação-sensível H ₂ DCF-DA (Invitrogen) para obter uma concentração final de 10 mM em ECM (meio extracelular: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO _3, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 1,2 mM MgSO _4, 2 mM CaCl _2, 10glucose mM e 2,0% de dextran, pH 7,4; todos obtidos da Sigma) contendo BSA 2% para os pratos e as células incubar por 20 min antes visualização sob microscopia confocal.
4. Depois de carregar dye, visualize as células colocadas em um palco temperatura controlada de um sistema de imagem apropriado. Usamos Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagem confocal juntamente com fonte de laser de argônio em um íon de excitação de 488 nm para DCF fluorescência usando objetivo de petróleo 40x ¹³ (Fig. 1A e D).
5. Analisar imagens usando software ImageJ (1,44), software disponível gratuitamente a partir do National Institutes of Health (Rasband, WS, ImageJ, EUA National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA, http://rsb.info.nih.gov/ij / , 1997-2009).

2. Visualização das operações principais de refinanciamento em células J774

1. Crescer J774.1 rato macrófagos derivados de monócitos (10 ⁶ células / ml) em fundo de vidro de 35 mm pratos (Harvard Apparatus) durante 48 h.
2. Desafio as células com ligantes TLR para induzir OPR de produção (2 mg / ml, Lipo-Teicóicos ácido TLR2; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 h, a 37 ° C.
3. Adicionar superóxido mitocondrial indicador MitoSOX Red (Invitrogen) para dar uma concentração final de 5 mM em ECM contendo BSA 2% para os pratos e as células incubar por 30 min a 37 ° C para permitir carregamento de MitoSOX Vermelho.
4. Depois de carregar dye, visualize as células em um estágio de temperatura controlada de uma lente Carl Zeiss LSM 510 Meta confocal casal sistema de imagem com Argon fonte de laser de íons em uma excitação de 561 nm para MitoSOX Red fluorescência usando objetiva 40x de óleo (Fig. 1B e E).
5. Para os experimentos de controle, depois de carregar adicionar corante PBS ou DMSO (controle negativo) ou Antimicina 2μM A. (Como superóxido mitocondrial de controle do gerador-positivo) para as células antes de a imagem da amostra, conforme descrito em 2.4 (Fig 1C)
6. Analisar as imagens usando o software ImageJ (1,44).

3. Visualizatiem citosólica de ROS na estáveis ​​Hyper-cito MPMVECs

1. Usamos pHyPer-cito (Evrogen) uma codificação de vetor de expressão de mamífero uma hiper sensor fluorescente que localiza no citoplasma e especificamente a concentração sentidos submicromolar de H ₂ O ₂ ^14.
2. Transfectar murino pulmonar células endoteliais microvasculares (MPMVECs) com pHyPer-cito vector usando eletroporação ou reagentes de transfecção. Nós usamos 10 x 10 ⁶ células e transfecção com 10μg de pHyPer-cito via eletroporação usando BioRad Gene pulser sistema electroporator (250V, 500 mF). MPMVECs cultivo em meio DMEM suplementado com 10% FBS, aminoácidos não essenciais, suplemento de crescimento endotelial e antibióticos.
   Nota: Após transfecção, as células da placa em baixa densidade para facilitar o crescimento da colônia.
3. Substituir médio com meio de cultura completo suplementado com 500 mg / ml G418, 48 horas após transfecção. Tela para clones que têm maior percentual de H yper células positivas ea passagem Hiper clones positivos para aumentar o número de hiper células positivas (Fig. 2).
   Nota: Nós usamos diluição seriada de células para a seleção clonal de células individuais e tela para as células altamente estáveis ​​expressando Hyper.
4. Crescer estável Hyper-cito MPMVECs em 0,2% de gelatina lamínulas revestido (80 confluência%). Células dia seguinte desafio com ligantes TLR (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 horas a 37 ° C. Células não tratadas servir como controle.
5. Após o tratamento, montar as lamelas em Attofluor células na câmara (Invitrogen). Adicionar 1 ml de pré aquecido Hanks solução salina balanceada (HBSS) para a câmara e colocar a câmara em um palco temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta confocal sistema de imagem. Visualizar e mudar a imagem de fluorescência de uma excitação de 488 nm usando objetiva 40x de óleo (Fig. 3A e D).
6. Analisar imagens usando software ImageJ (1,44) (ver secção 6).

ESIGNAÇÃO "> Visualization 4. mitocondrial de ROS na estáveis ​​Hyper-dMito MPMVECs

1. Usamos pHyPer-dMito (Evrogen) uma expressão de mamíferos vetor de codificação mitocôndrias Hiper-alvo que localiza na concentração sentidos mitocôndria e, especificamente, submicromolar de H ₂ O _2.
2. MPMVECs transfecção com pHyPer-dMito e gerar estável Hyper-dMito MPMVECs seguintes passos descritos na secção de 3,2-3,3.
3. Crescer estável Hyper-dMito MPMVECs em 0,2% de gelatina lamínulas revestido (80 confluência%).
4. Células dia seguinte desafio com ligantes TLR (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 horas a 37 ° C. Células não tratadas servem como controle negativo. Adicionar Antimicina 2μM A amostra (superóxido mitocondrial controle indutor positivo) antes da visualização.
5. Após o tratamento, montar as lamelas em Attofluor células na câmara (Invitrogen). Adicionar 1 ml de solução pré-aquecida de sal equilibrada Hanks (HBSS) para a câmarae colocar a câmara em um palco temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagem confocal. Visualizar e mudar a imagem de fluorescência de uma excitação de 488 nm usando objetiva 40x de óleo (Fig. 3B, C e E).
6. Analisar imagens usando software ImageJ (1,44) (ver secção 6).

5. Co-cultura modelo para a visualização de parácrinos derivados ROS desencadeada Ca ^{2 +} de sinalização em células endoteliais

Para a visualização e medição de [Ca ^{2 +]} i mudanças que usar um Ca ^{2 +} sensíveis corante fluorescente fluo-04:00 (Invitrogen).

1. MPMVECs crescer em 0,2% de gelatina revestidos lamínulas de vidro 25mm (80 confluência%).
2. Incubar as células cultivadas em lamínulas em temperatura ambiente por 30 min em ECM contendo BSA 2% e ácido PLURONIC 0,003% com 5 mM fluo-04:00 concentração (Invitrogen) final para permitir carregamento de fluo-04:00. Depois de carregar, lavar as células com uma solução de imaging experimental (ECM contendo 0.25% BSA) contendo sulfinpirazona para minimizar a perda de corante.
3. Depois de carregar fluo-4, monte lamínulas para Attofluor células na câmara (Invitrogen). Adicionar 800μl de pré aquecido solução de imagem experimental para a câmara e colocá-lo em um palco temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagem confocal.
4. Em uma etiqueta do tubo separar os macrófagos ativados ou não ativadas isolado de qualquer tipo selvagem ou gp91 ^{phox-/ -} ratos (tratados com LPS por 6 hr) com rastreador celular vermelho CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) em ECM contendo BSA 2% e ácido PLURONIC 0,003%. Lavar e ressuspender as células com 200μl de solução de imaging experimental.
5. Adicionar macrófagos marcados para fluo-04:00 carregado MPMVECs na montagem de câmara.
6. Registre a fluorescência verde e vermelho a cada 3s por 10-20 min usando Carl Zeiss LSM510 Meta sistema de imagem confocal com uma fonte de laser de argônio ion com excitação a 488 e 561 nm para fluo-04:00 e rastreador celular fluorescência vermelha respectively (Fig.4 AC).
   Nota: Como alternativa, J774.1 linhagem de células poderiam ser usadas para provocar MPMVECs Ca ^{2 +} mobilização.
7. Analisar fluo-4 mudanças de intensidade de fluorescência usando software ImageJ (1,44) (ver secção 6).

6. Análise de dados usando software ImageJ

Transferir as imagens obtidas a partir do sistema confocal como um arquivo de formato. Lsm para análise de dados. ZEN ZEN 2009 e 2010, desde software com microscópio LSM 510 Meta ou confocal LSM 710 microscópio confocal multifotônica respectivamente salva os arquivos em formato. Lsm. Recomendamos o uso desse nativo. Lsm arquivos para análise de imagens como a qualidade original é mantida. Este formato de arquivo pode ser diretamente aberto em análise de imagem programa Image J. Os passos seguintes são um exemplo de análise quantitativa de imagem única. Sem plugins adicionais são necessários para a análise desses dados.

1. Lsm. Abertas ou arquivo. TIFF no programa Image J usando FILE> OPEN
2. Clique na guia IMAGE> COCANAIS LOR> SPLIT e dividir os canais verde e DIC. Use a imagem do canal verde para análise posterior.
3. Dê um duplo clique e selecione o "Elliptical escova seleção tab" e defina o valor de pixels a 20.
4. Para o Hyper-cito imagens, clique em uma única célula para definir a área circular de medição. Em seguida, pressione "M" para medir a intensidade da área selecionada. Os valores são mantidos em uma janela de novos resultados.
5. Em seguida, segurando "Shift", clique em uma célula-chave diferentes para selecionar uma outra área, seguido da opção "M". A intensidade é registrado na janela de resultado. Repita os passos 4-5 na 50 células diferentes.
6. Para o Hyper-d mito imagens, defina o valor de pixels a 10 na seleção escova elípticas. Região de interesse (ROI) tem de ser rastreada manualmente incluindo as mitocôndrias das células particular.
7. Usando freehand, trace a região de cerca de mitocôndrias e pressione "M". Repita os passos 6-7 em 50 células diferentes.
8. Copie o me valores de uma janela de resultados e cole em uma folha de Excel ou qualquer outro software para plotar os resultados. Usamos tanto SigmaPlot ou GraphPad Prism para plotar os dados como gráfico.

7. Resultados representante

A Figura 1 mostra citosólica e mitocondrial de produção ROS após desafio com ligantes TLR. Representante imagens confocal mostram aumento de DCF (citosólicos) e Red MitoSOX (mitocôndrias) fluorescência após 6 horas de estimulação. Mudanças de fluorescência foram normalizados e expressa como alteração fold.

A Figura 2 mostra a geração de estável Hyper-cito e Hyper-dMito células endoteliais. Células endoteliais do mouse foram transfectadas com pHyPer-cito ou pHyPer-dMito constrói plasmídeo via eletroporação. Células plasmídeos expressando estavelmente foram selecionados com G418 por duas semanas. Após a seleção, as células diluídas foram semeadas em placas de 96 também. Colônias individuais foram isolados e fotografada para a expressão homogênea.

e_content "> Figura 3 mostra a medição da endoteliais citosólica e mitocondrial H ₂ O ₂ níveis. Representante imagens confocal mostram o aumento do Hyper-cito (citosólicos) e hiper-dMito (mitocôndrias) fluorescência após 6 horas de estimulação. alterações de intensidade de fluorescência foram normalizados e expressa como alteração fold.

A Figura 4 mostra a avaliação dos macrófagos derivados de ROS induzida endotelial citosólica Ca ^{2 +} mobilização. LPS-estimulado macrófagos pulmonares foram adicionados em células endoteliais microvasculares (PMVEC) que tinha sido previamente carregado com o Ca ^{2 +} intracelular ([Ca ^{2 +]} i) corante indicador de Fluo-4. Aplicação de tipo selvagem LPS-macrófagos ativados evocou uma [Ca ^{2 +]} i aumento PMVECs que foi atenuada por nocaute de oxidase NADPH funcional (gp91 ^{phox-/ -).}

Figura 1. Visualizatiem celulares de macrófagos gerada ROS e superóxido mitocondrial. J774.1 células foram desafiados com ligantes TLR2, 3 e 4 (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg/ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4). Por 6 h em 37 ° C. Após tratamento as células foram carregadas com (A) celular ROS indicador (H ₂ DCF-DA; fluorescência verde) ou (B) O indicador de superóxido mitocondrial (MitoSOX Vermelho; fluorescência vermelha). (C) A Antimicina foi usado como um controle positivo para a produção de ROS mitocondrial. Alterações intensidade de fluorescência foram avaliadas através de microscopia confocal. (D) e (E) A determinação quantitativa da mudança de fluorescência média.

Figura 2. Representação esquemática de geração de expressão estável de citosólica das células endoteliais e indicadores mitocondrial ROS.

Figura 3. V. isualization da endoteliais citosólica e mitocondrial H ₂ O ₂ níveis MPMVECs expressar de forma estável (A) Hyper-cito ou (B) Hyper-dMito foram desafiados com TLR2, 3 e 4 ligantes (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicóico; 10μg / ml, Poly (I: C)-TLR3; 1 mg / ml LPS-TLR4) por 6 horas a 37 ° C. (C) A Antimicina foi usado como um controle positivo para a produção de ROS mitocondrial. Após o tratamento, alterações de intensidade de fluorescência foram avaliadas através de microscopia confocal. (D) e (E) A determinação quantitativa da mudança de fluorescência média.

Figura 4. Macrófagos derivados de ROS provocar deficiência de células endoteliais Ca ^{2 +} mobilização. (A) Representação esquemática de células endoteliais / estudo do modelo de macrófagos co-cultura. (B), recentemente isolado macrófagos murinos de ambos os WT e camundongos gp91phox nulo (O Laboratório Jackson) foram ativadas por 1 mg / ml LPS por 6 h. Macrophages foram marcados com células-tracker Red (vermelho) e depois acrescentada a Fluo-4 PMVECs carregado (verde) para avaliar parácrina O ₂ ^{• -.} sinalização (C) LPS-activated macrófagos isolados de camundongos WT desencadeou grandes e rápidas Ca ^{2 +} mobilização PMVECs em comparação com macrófagos de camundongos nulos gp91phox. Validação de ativação de macrófagos tem sido demonstrada anteriormente.

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Discussão

O método descrito aqui permite a medição rápida e quantitativa de espécies reativas de oxigênio em células vivas ou usando corantes de oxidação ou sensores sensíveis plasmídeo. Agonistas de TLRs (Toll-like receptors) são compostos que estimulam as células através dos TLRs presentes na superfície das células e acionar as vias de sinalização a jusante ^15. Em nosso protocolo, usamos três diferentes TLR viz agonistas, Lipo-Teicóicos acid-agonista TLR2; Poly (I: C). TLR3-agonista; LPS-TLR4 agon...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente	Companhia	Número de catálogo
Attofluor câmara de celular	Invitrogen	A7816
A Antimicina	Sigma Aldrich	A8674
DMEM baixa glicose	Invitrogen	10567-014
Suplemento de fator de crescimento endotelial (ECGS)	Norte do estado	02-102
Soro fetal bovino	Invitrogen	12662011
G418	Invitrogen	10131-027
Gelatina	Sigma Aldrich	G1393
H 2 DCFDA	Invitrogen	D-399
LPS	Sigma Aldrich	L4516
LTA	Sigma Aldrich	L2515
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008
Opti-MEM eu Redução Médio de soro	Invitrogen	51985091
Pen / Strep (10x)	Invitrogen	15140163
pHyPer-cito	Evrogen	FP941
pHyPer-dMito	Evrogen	FP942
Poli (I: C)	Sigma Aldrich	P0913
Prism software 5,0	GraphPad Software, Inc.
SigmaPlot 11,0	Systat software, Inc.
Tripsina-EDTA (10x)	Invitrogen	15400054
T-25 Frascos	Corning	430639
T-75 Frascos	BD Falcon	353136
96-T bemC micro placa bem	BD Falcon	353072
Zen software 2009	Carl Zeiss 510 microscopia confocal Meta