לשעבר vivo הכנה מבודדת Microvessel השלד לחקירות תגובתיות כלי דם

Summary

לשעבר vivo מתואר על הבידוד של השרירים הגדולים gracilis arterioles ההתנגדות לחקירה של שני כלי דם התגובות לגירויים vasoactive והערכת תכונות מבניות בסיסיות באמצעות מכניקת קיר פסיביים.

Abstract

הכנה microvessel מבודד הוא הכנה vivo לשעבר המאפשר בחינה של תרומות שונות של גורמים בקוטר כלי שליטה, וכך, התנגדות זלוף ^1-5. זהו תכשיר ניסיוני קלאסי זה היה, במידה רבה, תיאר בתחילה על ידי אושידה et al. ¹⁵ לפני כמה עשורים. זה תיאור ראשוני סיפק את הבסיס הטכניקות שונה בהרחבה משופרת, בעיקר במעבדה של ד"ר בריאן Duling באוניברסיטת וירג'יניה ^6-8, ואנחנו מציגים גישה הנוכחי בעמודים הבאים. הכנה זו באופן ספציפי מתייחסים עורקיק gracilis בחולדה כמו microvessel של בחירה, אבל ההכנה הבסיסית יכול בקלות להיות מיושם על כלי מבודדים מרקמת כמעט כל איבר אחר או על פני מינים ^9-13. מכני (כלומר, מימדי) שינויים microvessels בודד יכול בקלות לעבור הערכהבתגובה מגוון רחב של פיזיולוגיים (למשל, לחץ היפוקסיה, intravascular, או גזירה) או אתגרים תרופתי, והוא יכול לספק תובנות לגבי האלמנטים המרכיבים מכניסטית תגובות המשולבים ללא פגע, אם כי רקמת vivo לשעבר. המשמעות של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת מניפולציה קליל של ההשפעות על תקנה משולבת של קוטר microvessel, תוך המאפשר שליטה של ​​רבים תרומות ממקורות אחרים, כולל לחץ intravascular (myogenic), עצבוב האוטונומית, hemodynamic ( למשל, מאמץ גזירה), גירויים התלויים או עצמאית אנדותל, הורמונליים, והשפעות parenchymal, כדי לספק רשימה חלקית. תחת תנאי הניסוי מתאימים ועם המטרות המתאימות, זה יכול להוות יתרון על פני in vivo או ברקמות / איברים ההכנות באתרו, שאינם מאפשרים בקלות עבור קליל של משתנים מערכתיות רחבות יותר.

תואר שניהגבלה יור הכנה זו היא למעשה תולדה של נקודות החוזק שלה. על פי ההגדרה, את ההתנהגות של הכלים האלה הוא נחקר בתנאים בהם רבים התורמים המשמעותיים ביותר בוויסות של התנגדות כלי הדם הוסרו, כולל עצבית, הלחות, חילוף החומרים וכו 'על כן, החוקר הוא הזהיר, כדי למנוע יתר פרשנות אקסטרפולציה של הנתונים אשר נאספו תוך שימוש בתכשיר זה. אזור משמעותי אחר של דאגה לגבי הכנה זו היא כי זה יכול להיות קל מאוד לגרום נזק לרכיבים תאיים כמו רירית האנדותל או השריר החלק בכלי הדם, כגון מקור משתנה הטעות יכול להיות מוצג. מומלץ מאוד כי החוקר הפרט לנצל מדידות מתאימים כדי להבטיח את איכות של התכשיר, הן התחלת הניסוי ומדי פעם במהלך כל פרוטוקול.

Protocol

1. לפני הניסוי

1. לפני יום הניסוי, צינורות זכוכית נימי של ממדים המתאימים עבור תחנת נמשכים לתוך micropipettes (או חולץ אופקי או אנכי ניתן להשתמש). קוטר קצה ניתן להתאים בקלות בהתאם כלי בידוד, למרות שאנו בדרך כלל להשתמש במגוון קוטר בין 50-150 מיקרומטר. אלה מכופפים אז לתצורה המתאימה לחימום הבאה microvessel תחנת על אש בוטאן. טיפים micropipette שבורים פיזית קוטר משוער (עם מלקחיים עדינים) עבור microvessel המדובר ויכול הקרקע או מלוטשת על תצורות המתאימות, לפי הצורך עבור יישום ספציפי. לסקירה נרחבת מצטיין על הליכים אלה, הקורא מופנה דייויס ואח'. ^16. שני micropipettes מונחים אל בעלי פיפטה עבור החדר microvessel באופוזיציה. אלה חייבים להיות מכוונים כך את הטיפיםהן במישור אנכי ואופקי אותו בתוך החדר כלי.
   תא microvessel להשתמש בכתב היד הזה (איורים 1 ו -2) הוא אחד כי הוא מותאם אישית שנבנה על ידי מר דוד Eick במחלקה לפיזיולוגיה בבית הספר לרפואה של ויסקונסין ( http://www.phys.mcw.edu/ ו www . eicktech.com ). עם זאת, תצורות אחרות של החדר microvessel זמינים מסחרית, עם אלה שפותחו על ידי מכשור מערכות חיות ( http://www.livingsys.com/ ) ו IonOptix ( http://www.ionoptix.com/ ) להיות נפוצה מאוד. באמצעות אלה למערכות אחרות, זה עשוי להיות הכרחי כדי לנצל מיקרוסקופ הפוכה ולא 1 זקוף המקובלת, אם כי זה תלוי בניסוי ספציפי ודרישות ציוד. השימוש של מיקרוסקופים הפוכה יהיה עדיף protoc ניסיוניOLS הדורשים הדמיה ניאון או confocal.
2. הכן תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS, המפורטים להלן) ולהבטיח pH מוגדר רמות מתאים תנאי הניסוי ספציפיים (7.38-7.42 אופייני ונופל בטווח הפיזיולוגי). פתרון PSS יכול להיות מוכן מראש ואת בקירור אלא יש לבדוק את הטמפרטורה המתאימה pH לפני השימוש. PSS יכול להכיל אלבומין אם הניסוי או פרוטוקולים ספציפיים דורשת את זה, אם כי זה לא חובה אוניברסלית.
3. מחוגה וידאו דיגיטלי למדידת קוטר כלי צריך להיות מכויל באמצעות hemocytometer או בשלב מיקרומטר מיקרוסקופ. עבור כיול מדויק, היא חיונית, כי מיקרומטר להציב אותו מישור כמו יבוא / יצוא micropipettes בתא כלי.
4. לולאות עניבה לחיבור microvessel על בטפי להחדרת נוזלים צריך להיות מוכנים ולהיות נגיש לשימוש מאוחר יותר. אלה יכולים בקלות להיות מוכן 8-0 או קטן יותר של עינייםuture. לולאה אחת עניבה אפשר להכין מראש ולאחסן בצלחת פטרי מכוסה על רצועת קטנה של סרט הפוך סביב שקופיות מיקרוסקופ עד הצורך (זה ישמור עליהם מפני אובדן). (איור 3).

2. יום של הניסוי

1. כל הציוד התומך צריך להיות מופעל בדק לתפקוד תקין. זה כולל את השולחן anti-vibration/floating ואת אמבטיה במחזור מים מחוממת (ערוך לספק את הטמפרטורה המתאימה באמבטיה כלי - בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס), כל מתמרים הלחץ וחדר כלי משאבת הניקוז (איור 1A ו-1B). הפעל את הגזים איזון בתא כלי והן perfusate ואת מאגרי superfusate.
2. למלא את כל המאגרים, צינורות, ותאי עם פתרון PSS. קו perfusate המוביל פיפטה יבוא חייב להיות מלא לחלוטין, כדי למנוע את נוכחותו של בועות אוויר בתחום הזה אשר יכול לסלק נזק VAscular האנדותל (איור 1 ג). במידת הצורך, להשתמש המזרק בעדינות את PSS לאורך כל הדרך פיפטה כדי להבטיח כי הוא מלא לחלוטין וללא חסימה שעלול לעכב זרימת perfusate. הלחץ יבוא צריך להישמר בגבולות סבירים כדי למנוע נזק מתמרים לחץ.

3. Microvessel קצירת

1. בעקבות anesthetizing של החיה שממנה microvessel היא שיש לנקוט, כלי המדובר אמור להיות מבודד פי הנהלים המתאימים ביותר vasculature להיחקר. במקרים מסוימים, זה עשוי לדרוש הסרת איברים עצמו (למשל, microvessels מוחין או הכליליים), ואילו באחרים, כלי ניתן להסיר ישירות חיה הרדים (למשל שריר). למשל נטייה של כלי בתוך השריר gracilis מוצגת באיור 4. לאמוד את אורכו של כלי השיט in vivo לפני הסרת איתוceps ובמדי הקוטר או קטנים. לפני הסרת כלי מבעל חיים / איברים, זה יכול להיות מועיל מאוד לבצע בדיקה סופית נוספת כדי לוודא קאמרית כלי מוכן כהלכה (כולל את כל לולאות עניבה במקום).
2. הסר את כלי מבעל חיים / איבר ידי אחיזה בצד החיצוני של הספינה בקצה אחד עם מלקחיים עדינים חיתוך לאורכו של כלי השיט עד שהוא חופשי, לקחת בזהירות רבה, כדי למנוע כל מושך או מושך את האוניה. לשחרר פעם אחת, מיד למקם אותו צינור צנטריפוגות 1.7 מ"ל מלא PSS אבל לא לוותר על הספינה. זה לזכור את הכיוון, כך כיוון perfusate באמבטיה יהיה זהה לכיוון זרימת הדם בתוך החיה.

4. Cannulating כלי השיט

1. מניחים את כלי באמבטיה מלאה ו cannulate סוף הפרוקסימלי על פיפטה יבוא. זה יכול להיות מושלם הטוב ביותר עם שיעור זלוף צנוע באמצעות צינורית (~ 50 מ"מ כספית בלחץ) וזוג מלקחיים עדינים נהג להחזיק כל צד של כלי הפרוקסימלי לומן קיר (כלומר, זוג מלקחיים בכל יד). במעבדה שלנו, אנו משתמשים מלקחיים עדינים בין כלי מדעי בסדר ( http://www.finescience.com/Home.aspx ), אם כי כל מלקחיים שנבנו בהתאם יעבוד ביעילות. להחליק את הכלי על קצות הצינורית ולקדם את הספינה על קצה עד לנקודה שבה שתי לולאות עניבה יכולה לאבטח את כלי השיט.
2. להעלות את הלחץ יבוא על 75 מ"מ כספית ~ להמשיך לנפח את הספינה ולאפשר cannulation על קצה דיסטלי פיפטה. זרימה דרך כלי יש לראות עיוות במאגר superfusate על יצוא של כלי דיסטלי (תחת מיקרוסקופ). Cannulate סוף דיסטלי של כלי השיט על פיפטה יצוא ולאבטח את זה עם שתי לולאות לולאות עניבה (אלה האחרונים צריך להיות במקום לפני cannulation, איור 5).
3. כוון את צינורית עד שבשנת קואורדינטות XYZ כמו needeD עד שלא יהיה עיוות מינימלי בכלי, ואת כלי אומדן של אורך vivo. להעלות את הלחץ יבוא עד שהוא אומדן של שיעור לחץ הדם הממוצע חווה בדרך כלל על ידי מגזר זה כלי (במעבדה שלנו מנצל 80% של לחץ הדם הממוצע עבור arterioles התנגדות גדולה של שרירים gracilis ^8).
4. מניחים אבן קטנה מבעבע אספקת תערובת הדלק המתאים לאמבטיה ופלסטיק במקום לעטוף או כיסוי זכוכית על פני החדר, כדי למנוע מתיז את עדשת המיקרוסקופ. אנו משתמשים אבן מבעבע זה זמין בדרך כלל על חיית המחמד כל / חנויות האקווריום הוא כ 1 ס"מ קוטר, אם כי גודל קטן יותר תעבוד בצורה יעילה גם כן. נוכחות של אבן מבעבע מבטחת זמינות הגז המתאים לכלי בכל עת ירחיבו הכדאיות כלי. אבן זו תוסר במהלך כל תקופת המדידה (או זרימת אוויר דרך אבן קטעה באופן זמני), כדי למנוע עיוות שלהתמונה. שחרר את מהדק על פיפטה יצוא ולאפשר זרימה דרך כלי השיט במשך 30 דקות. מעת לעת, זרימת יש הידק את צינורות יצוא כדי לקבוע אם כלי מפתחת הטון מנוחה. כל כלי יש לבדוק אם קיימת דליפה של לחץ בשלב זה. דליפות יהיה ניכר על ידי החדרת הלחץ ידועה לכלי (אנחנו בדרך כלל להשתמש 100-120 מ"מ כספית) ו מהדק את תזרים, ואחריו יבוא, קווים. אם הלחץ intraluminal יציב, אין הדלפות ניכר. עם זאת, אם הלחץ מתחיל לרדת, דליפה משמעותית נוכח והוא חייב להיסגר. הדלפות על יבוא או בטפי להחדרת נוזלים תזרים בדרך כלל, ניתן לתקן על ידי הוספת לולאה נוסף קשור סביב הספינה על פיפטה. לחלופין, אם כלי יש ענף צדדי קטן, כי הוא מאפשר דליפה, זה יהיה להתפשר על יכולת כלי להכיל את הלחץ באופן יעיל והוא יכול להציג את מקור נוסף לטעויות. אם זו דליפה מזוהה, זה יכול להיות קשור בדרך כלל את wלולאה ith אחת של תפר 10-0 opthalmic. לחלופין, גדיל בודד התגרו מ תפר 6-0 לעשות את הלולאה עניבה הוא גם יעיל מאוד. אם הדליפה לא ניתן לזהות או לא יכול להיות קשור בצורה יעילה את (למשל, אין גזע לענף בצד ופשוט חור בקיר כלי), זה עלול להוביל לסיום מוקדם של ניסוי ושימוש של כלי חלופי להיות הצורך (זה בדרך כלל כלי זהה ברגל השנייה - או הצד הנגדי אם יש צורך - של בעל חיים).
   
   הכלי צריך להיות מותר לאזן בשום תנאי הזרימה עבור מינימום של 30 דקות. כל הניסויים נערכים תחת שום תנאי הזרימה. ברגע כלי פיתחה צליל משביע רצון, והוא מגיב על קריטריוני ההכללה של הניסוי האמור, כלי מוכן המחקר שלאחר מכן.
   
   אלה קריטריוני ההכללה יכול להשתנות בהתאם לפרוטוקול הניסוי החוקר ספציפית. במעבדה שלנו, אנחנו באופן שגרתי UTilize את הפעולות הבאות:
   1. הטון פעיל של> 30% (כפי שחושב ΔD / D _מקס x 100, שם ΔD היא העלייה בקוטר arteriolar הקיר הפנימי מהערכים בלחץ איזון בתגובה חשיפה Ca ^{2 +} ללא PSS ו-D _מקס הוא לכל היותר קוטר נמדד בלחץ איזון בין ² Ca ⁺ ללא PSS).
   2. הפעלת Myogenic (תחזוקה, או עדיף ירידה, קוטר arteriolar עם לחץ מוגבר intraluminal) כמדד של שכבת השריר כלי דם קיימא חלקה.
   3. רירית האנדותל קיימא, כפי שמעידים תגובה מהירה מרחיב את האצטילכולין (10 ^-6 M באמבטיה).
   4. קריטריוני ההכללה ניתן להוסיף כדי להתאים את פרוטוקול הניסוי ספציפי לפי הצורך, כולל התגובות נחש ל אגוניסטים adrenergic כגון phenylephrine (10 ^-7 מ '), מרחיב התגובות לגירויים נוספים, כגון אדנוזין (10 ^-5 M) או היפוקסיה (ירידה% 0 O ₂ בגז איזון).
5. הסעיף הבא הוא דוגמה של "ניסוי מדומה". כל הפתרונות הנדרשים מוכנים על פי הצורך, עם תשומת לב שילם לחשבון גורם לדילול של PSS בתא כלי. לדוגמה, עבור חלק מהציוד שלנו, נפח תא כלי השיט הוא 20 מ"ל. כמו μl, כגון 20 של מספר 10 ^-2 פתרון ז התוצאות המניות ריכוז יעיל של M 10 ^-5 באמבטיה קאמרית כלי. בעקבות הסרת כלי איזון, cannulation ואימות כמתואר לעיל, הניסוי הוא מוכן להתחיל. פרטים כגון אקראיות הטיפול ויעילות הן ספציפיות הניסוי היו צורכים שטח מוגזמת למאמץ זה. לפיכך, אלה אינם נכללים בפירוט.
   
   התגובות הראשוניות בקרה נחושים. עבור גירוי פיזיולוגי כמו למשל הפעלת myogenic (לחץ הנגרמת התכווצות), intralumenal יחסי ציבורessure משתנה באופן אקראי בטווח הרצוי, כלי מותר תקופת הזמן המתאים להגיב (במקרה זה, היינו לאפשר תקופת 5-7 דקות). לגירוי למשל תרופתי כגון האתגר עם אצטילכולין, התרופה תתווסף חזרה מפתרונות מניות בסדר אקראי. במקרה כזה, היינו משתמשים בו בדרך כלל נע בין 10 ל ^-9 מ ^-5 10 באמבטיה, עם סחף להיות מוגדר שיקום בקוטר איזון. כמו אצטילכולין הוא סוכן לפעול מהר, תגובות מרחיב מקסימלי יכול בקלות להיות מושגת רק כמה שניות. סוכנים אחרים (כגון פפטידים) יכול לקחת עוד הרבה זמן כדי לעורר תגובה מקסימלי וזה הרבה יותר לקחת בחשבון, כמו גם פרק הזמן שלוקח סחף יעיל. אחת התגובות שליטה כבר נאסף, התערבויות ספציפיות ניתן להטיל על המערכת, כולל הדגירה של כלי השיט עם אגוניסטים לקולטן / היריבים, סוכנים הפועלים על תעלות יונים מסוימות, ביוזמתה שלהלחץ intraluminal שונה, הבדלים גזים איזון תרופתי או סוכנים המכוונים מערכות אנזימטיות מסוימות, אם למנות כמה מן ההתערבויות הנפוצות ביותר.
   
   לאחר זמן מתאים להתערבות יעילה (אשר יש לבדוק כראוי), בסיבוב הבא של איסוף הנתונים יכול להיות יזם. בהתאם לפרוטוקול הניסוי הספציפי, התערבויות הבאים ניתן להטיל על כלי השיט או 1 ניתן להסיר (או על ידי סחף - הסרת או פשוט אתגר פיזיולוגי - ריאלי כאשר). ברגע כלי חזר למצב איזון שלה (שאמור להיות מאומת), התערבויות הבאים ניתן ליישם לפי הצורך עם נתונים נוספים שנאספו. הליך זה בכלל היה נמשך עד תום הניסוי או עד איכות הכנת כלי יורדת מתחת סף הקריטריונים שנקבעו בעבר (למשל, בתגובה אגוניסט או את היכולת לפתח את הטון פעיל מספיק). בשלב זה, הניסוי הסתיים או כך, או חוקר מומלץ לאסוף מידע שאינו תלוי תגובתיות של כלי בודד (כמו המכניקה של הקיר כלי, אשר ניתן לבצע באמצעות ההליך זהה של הפעלת myogenic, רק עם כלי חסר כל צליל פעיל ^14).
6. ניקוי קבוע של כל ציוד חיוני להסרת הצטברות מלח ומניעת צמיחה של כל ישויות ביולוגיות בלתי רצויות. בסופו של יום הניסוי, לכל הפחות, את כל קווי ותאי סמוקות לחלוטין עם כמויות עצומות של מים מזוקקים או דה מיונן של PSS ואפשרו לו להתייבש לחלוטין. אחרי כל 2-3 ימים של שימוש, לשטוף עם אתיל אלכוהול מבוצע גם והציוד מותר לייבוש מלא. בסופו של כל שבוע של שימוש רציף, קווים כל ותאי מלאים חומצה הידרוכלורית 0.1 מ ', מותר "דגירה" במשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף היטב במים לעיל. לבסוף,בסופו של 2-3 שבועות של שימוש רציף, כל החלקים של צינורות מוחלפים חדש קאמרית מאגרי מנקים עם 1.0 מ 'HCl ואחריו רב שטיפה עם מים מזוקקים / דה מיונן. אם כל שינוי צבע של הקמת צינורות או חזותי של צמיחה בצינור או כל אלמנט של תא / מאגרים אלה מוחלפים או ניקוי יסודי על פי הצורך. עם ניקוי קבוע ותחזוקה כללית, ציוד יכולה להימשך זמן רב מאוד. בזמן כתיבת שורות אלה, לתאי כלי שלנו הם כולם לתוך ^ה שלהם 8 או 9 שנים ^ה של שימוש שגרתי ואנחנו חווים כל קושי משמעותי איתם.

5. נציג תוצאות

איור 1 א. נתון זה מציג את ההגדרה הבסיסית תחנת microvessel. טלוויזיה = עבור כלי צפייה, B = מחוגה דיגיטלית, C = מזרק על שדחף superfusate thr פיפטה ough יבוא לפי הצורך; D = טור ההידרוסטטי לשינוי הלחץ יבוא perfusate: E = מיקרוסקופ, F = microvessel קאמרית, G = superfusate המאגר, H = לחץ צג (מרובים ניתן להוסיף לפי הצורך), אני = microvessel קאמרית משאבת הניקוז עבור superfusate: J = גז איזון מיכל תערובת, K = בזבוז הכיל (על superfusate): L = דוד במחזור מים; M = שולחן anti-vibration/floating.

איור 1 ב. נתון זה מציג מבט קרוב יותר של הגדרת תא microvessel. בנתון זה, E = מיקרוסקופ, F = microvessel קאמרית, H = צג הלחץ (בעוד אנו מציגים רק לשם הפשטות, רב ניתן להוסיף אתרים שונים בהתאם לצורך), אני = microvessel משאבת תא הניקוז, צינורות N = מחובר מאוד תחילת פיפטה יבוא perfusate (המשך מ 'ד' באיור 1 א); צינורות מ = מצורף פיפטה יצוא perfusate.

class = "jove_content">
איור 1 ג. נתון זה מציג את הנוף הקרוב ביותר של החדר microvessel. בנתון זה, N = קו perfusate (כלומר, צינורות מחוברים ישירות פיפטה יבוא perfusate); מ = צינור המחובר ישירות פיפטה יצוא perfusate, P = הפקדים המיקום האופקי והאנכי עבור פיפטה יבוא, ש = superfusate לרוקן את האמבטיה במים (מחובר "אני" במספרים 1A ו-1B), R = יבוא על אמבט מים באים מן המאגר (מחובר 'G' באיור 1 א).

איור 2. נתון זה מהווה ייצוג סכמטי של זרימת נוזלים וגזים במערכת. בנתון זה, PSS = יבוא superfusate קו, ב = PSS קו perfusate על יבוא פיפטה, C = PSS superfusate בריחת מהאמבטיה לבזבז מיכל: D = PSS יצוא perfusate מ פיפטה יצוא: E = קלט מים חמים אל תוך המעיל קאמרית: F = תפוקת מים חמים מן המעיל קאמרית.

3. איור נתון זה מציג את הקשר היחיד לולאות עשוי תפר עיניים (נצפים מבעד למיקרוסקופ לנתח עם eyepieces 10x ו הגדלה 4.5x זום מתכווננת, לוח) המשמשים בהכנת שלנו אחסון של לולאות עניבה מספר 8-0 ו 10-0 תפר בקלטת הפוך סביב המיקרוסקופ שקופית אשר מאוחסן בצלחת פטרי מכוסה (כדי להימנע מאיבוד אותם; לוח ב ').

איור 4. נתון זה מספק תמונה (נצפים מבעד למיקרוסקופ לנתח רגילה) של עורקיק התנגדות השריר gracilis לפני הבידוד והסרה כירורגית, כדי לאפשר התמצאות מרחבית נכונה.

ve_content ">
איור 5. נתון זה מספק תמונה מייצגת של microvessel cannulated. לוח מראה לכל אורכה של הספינה, עם יבוא גם (א) ו יצוא (ב ') בטפי להחדרת נוזלים, כמו גם לולאות עניבה (ג) הראו. לוח ב 'מציג את התמונה בהגדלה גבוהה, מראה בבירור את הנחישות של הקוטר הפנימי arteriolar עם מחוגה דיגיטליות (במקרה זה הקוטר הוא 112 מיקרומטר).

איור 6. נתון זה מציג תמונות מייצגות של איזון microvessel cannulated הבאה. התמונה העליונה היא של כלי תחת שליטה, unstimulated תנאי בלחץ איזון היא התמונה האמצעית היא של כלי אותו בעקבות התרחבות לאתגר עם אצטילכולין (10 ^-6 M באמבטיה), והתמונה התחתונה היא של כלי כי בעקבות constriction כדי לאתגר עם phenylephrine (10 ^-7 M באמבטיה).

. איור 7 נתון זה מסכם את התגובות של microvessel מבודד בתגובה לאתגר עם: היפוקסיה (לוח א ', ירידה perfusate ו superfusate ת.ד. ₂ במערכת שלנו מ 135 מ"מ כספית ל ~ ~ 40 מ"מ כספית), ריכוזים הולכים וגדלים של אצטילכולין (לוח ב), שינויים בלחץ intravascular בתנאים בקרה הדגירה הבאה של כלי השיט עם סידן ללא PSS (לוח ג).

Discussion

פרוטוקול הציג מתאר cannulation, בידוד הסרת כפולה של microvessel שרירי השלד, אם כי טכניקה זו בכלל ניתן ליישם בקלות ברוב הרקמות. על כתב היד הנוכחי, המונח "עורקיק" נוצל בעבר על ידי החוקרים לתאר כלי התנגדות נע בין 70-120 מיקרומטר בקוטר תחת הטון פעיל מנוחה, שהיא גם תורמת רבות תקנה הה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
חומרים כימיים וציוד	חברה	תגובות / קטלוג #
כלי הקאמרית	מנהג	דייב Eick (MCW)
מים מחוממת מחזורי אמבטיה	PolyScience ו Haake	Haake DC 10
Pipets	פרדריק Haer ושות'	נימי Tubing 2.0 מ"מ OD x 1.0 מ"מ מזהה (27-33-1)
לחץ צג	Precision של מכשירים בעולם
מאגר מים במקטורן	מנהג
מקור אור חיצוני	Precision של מכשירים בעולם	Novaflex
Pipet פולר	MicroData מכשירים	PMP102 Micropipet פולר
מלא משליםment של כלים כירורגיים	מדע כלים עדינים	דומון
מלקחיים עדינים במיוחד	מדע כלים עדינים	Inox # 5
קשירת משי נושא	Ethilon	# 10-0 או 9-0
סטריאו מיקרוסקופ	אולימפוס	אולימפוס SZ-11
מחוגה וידאו אנלוגי	Boeckeler	באמצעות בקר (Via-100)
מצלמה ברזולוציה גבוהה אנלוגי	Panasonic	GP-MF 602
חמצן טנק	אזורי	חנקן האיזון 21% ו 5% CO 2 וחנקן איזון
צנור	Tygon
מסננים משאבה	קול בן הזוג Instrument ושות
עכברוש PSS שונה	ראו מתכון בהמשך
PSS להרפיית ואן Breemen של	ראו מתכון בהמשך

שונה PSS עכברוש מתכון	כדי להפוך את שני ליטרים של PSS	20X צילומים של מלח (2L)	20X למלאי (2L)
NaCl		278.0 גרם
KCl		14.0 גרם
MgSO 4-7H 2 O		11.5 גרם
CaCl 2-H 2 O		9.4 גרם
NaHCO 3			80.8 גרם
EDTA			0.4 גרם
לאא 2 PO 4	0.28 גר '
גלוקוז	1.98 גר '
20x מלח במלאי	100 מ"ל
20x מאגר צילומים	100 מ"ל
מים מזוקקים	1800 מ"ל

PSS להרפיית ואן Breemen של	כדי להפוך את 2 ליטרים של PSS	20X מלח במלאי (1 ליטר)	20X מאגר צילומים (1 ליטר)
NaCl		107.4 גרם
KCl		7.0 גרם
MgSO 4-7H 2 O		5.76 גר '
MgCl 2-6 שעות 2 O		81.32 גרם
NaHCO 3			40.4 גרם
EDT			0.2 גרם
EGTA			15.22
לאא 2 PO 4	0.28 גר '
גלוקוז	1.98 גר '
20x מלח במלאי	100 מ"ל
20x מאגר צילומים	100 מ"ל
מים מזוקקים	1800 מ"ל