לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

Summary

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה כרומוזום תסיסנית עוברים באמצעות לייזר Leica מערכת סריקה confocal.

Abstract

הרכבה ציר מחסום (SAC) המנגנון הוא אות הפעיל, העוקב אחר האינטראקציה בין kinetochores כרומוזום microtubules ציר כדי למנוע התפרצות anaphase עד הכרומוזומים מחוברים כראוי. תאים משתמשים מנגנון זה, כדי למנוע חוסר יציבות גנומית או aneuploidy, ולכן סרטן ומחלות אנושיות אחרות, כמו מומים מולדים ואלצהיימר ^1. מספר הרכיבים שק כגון Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, רוד ואורורה ב קינאז זוהו והם כל החלבונים דינמיים kinetochore ^2. הראיות עולה כי kinetochore הוא שם את האות SAC היא יזמה. המטרה העיקרית היא SAC הרגולציה Cdc20. Cdc20 הוא אחד APC / C (P naphase romoting omplex C או C yclosome) activators חיוניים ^3, והוא גם חלבון דינמי kinetochore ^4-6. כאשר מופעל, SAC מעכב את הפעילות שלPC / C כדי למנוע את הרס שני מצעים מרכזיים, cyclin B ו-securin, ובכך למנוע metaphase כדי anaphase המעבר ^7,8. בדיוק איך האות SAC הוא יזם התאספו על kinetochores את ומסר על הנגמ"ש / C לעכב את תפקידו עדיין נשאר חמקמק.

תסיסנית היא מערכת ניסיונית צייתן מאוד, אורגניזם פשוט יותר וטוב יותר מובנות לעומת האדם אבל אף אחד כי תהליכים מניות יסוד משותפים. זהו, אולי, אחד היצורים הטובים ביותר לשימוש עבור ביו הדמיה מחקרים בתאים חיים, במיוחד עבור הדמיה של אירועי mitotic במרחב ובזמן, שכן העובר בשלב מוקדם עובר 13 מחזורים מהירים חטיבת גרעיני באופן סינכרוני (8-10 דקות לכל מחזור של 25 ° C) ולאט לאט מארגנת גרעינים בשכבה יחידה בדיוק מתחת קליפת המוח ^9.

הנה, אני מציג את שיטת ביו הדמיה באמצעות מהונדס תסיסנית הבעהשרים GFP (חלבון ירוק זרחני) או חלבונים גרסה במיקוד שלה של ריבית TCS Leica SP2 confocal מערכת לייזר מיקרוסקופ סריקה כדי ללמוד את הפונקציה SAC אצל זבובי, על ידי הצגת תמונות של חלבונים GFP שילוב של כמה מרכיבים SAC, Cdc20 ו Mad2 , כמו בדוגמה.

Protocol

1. זבובים מהונדס ותחזוקה

1. מהונדס זבובים להשתמש בהפגנה: Ubq-GFP-Cdc20 (ב '), Ubq-RFP-His2B (X *); Ubq-GFP-Cdc20 (ב' *), Ubq-GFP-Cdc20 (ב '*); mad2 ^אי ( * III) ו-GFP-Ubq Cdc20 זבובים מהונדס נוצרו בעבר דרך הגישה P-רכיב סטנדרטי בתיווך מהונדס ^10,11 ו Ubq-RFP-His2B הוא מתנה מסוג מ Yohanns Belaïche ב UMR 144 CNRS / מכון קירי במעבדה, בפריז, צרפת. הם הוכנסו לתוך הרקע מוטציה Mad2 באמצעות תקן תסיסנית הגנטיקה. Mad2 הקו המקורי ^אי מוטציה נרכש המניות Bloomington במרכז. לא נדון הליך המשמש העלאת transformants בפרוטוקול זה.
   הערה: * מייצג את מספר הכרומוזומים.
2. תחזוקה: זבובים מהונדסים נשמרו על 25 מעלות צלזיוס צלוחיות פלסטיק containinגרם לעוף מזון עם אבקת נוסף שמרים יבשים על גבי. בקבוקון הוחלף באופן שגרתי כל 3-4 שבועות, תלוי תנאי גידול (איור 1).

2. טוס הכנת מזון (בסולם מעבדה)

1. כמות נאותה של תערובת מזון זבוב היה מחומם עם ערבוב מתמיד כדי לפזר את המרכיבים.
2. כ 8-10 מ"ל של מדיום זה הופץ כמו slurry לתוך בקבוקון כל פלסטיק (2.5 ס"מ קוטר x 8 ס"מ אורך), תוך שימוש מדעי Jencons משאבת בע"מ peristaltic.
3. כאשר slurry מזון נקבע והוא מקורר לטמפרטורת החדר, בקבוקון אז הוא מחובר לחשמל עם תקע קצף כותנה. צלוחיות מזונות אלו ממוקמות במגש כי הוא חתום ואז בשקית ניילון ושמרה על 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

3. בקנה מידה קטן ביצה אוסף

1. כ -50 זוגות של 2-3 זבובים ביום ישנים בוגרים הועברו בקבוקון מזון טרי זבוב מסופק עם אבקת נוסף שמרים יבשים על פני השטח במהירות של 25 ° C עבור מתנדביםלאינג עוברים.
2. הזבובים מועברים לאחר מכן בקבוקון טרי בכל שעה ולהשאיר את העוברים בבקבוקון במשך 30 דקות על מנת להבטיח כמה עוברי שנאספו הם בני 8-10 ברחבי מחזור גרעיני חטיבת כאשר גרעינים בהדרגה מעבר לקליפת המוח ומאורגן כמו אחד monolayer. אוסף השעה הראשונה תקין נמחק כפי שהוא מכיל בדרך כלל עוברים בגיל שהיו שמרו בגופם הנשי כאשר התנאים אינם מתאימים הנחת.

4. הכנת Coverslips ושקופיות

1. להוציא 50 x 22 מ"מ coverslip מעט להרטיב ארבע פינותיה בצד אחד עם כמות קטנה מאוד של מים בעזרת מברשת לחה עט בסדר לשים את זה בשקופית מיקרוסקופ כדי coverslip לא זז בגלל מתח הפנים נימי נגרמת על ידי הסרט נוזל דק.
2. החל רצועה דקה של דבק על פני heptane באמצע coverslip, heptane צריך להתאדות תוך שניות לעזוב את הדבק על coverslip.
3. גזור אחרת coverslip בעט יהלום לריבועים קטנים (~ 1.5 מ"מ ^2), לקחת את אחד ומניחים אותו על קצה אחד של רצועת דבק (זה משמש כדי לפתוח את חוד המחט, כאשר microinjection נדרש) ולשמור את השאר לעתיד לשימוש.
4. קח עוד שקופיות מיקרוסקופ ולתקוע נייר דבק דו צדדית דביק על 2 ס"מ אליה לקלף את נייר העטיפה. (ראה איור 2 א & B).

5. Dechorionate עוברים

1. להעביר את הזבובים כדי בקבוקון מזון טרי ולהשתמש במברשת לחלח בעט מצוין להעביר כ 50 ביצים על גבי קלטת דו צדדית דביק בשקופית עם כמות נאותה של נוזלים על מנת לאפשר את הביצים להיות פרושים. כאשר הנוזל מתאדה הביצים ידבק קלטת.
2. תחת מגע מיקרוסקופ לנתח את הביצים מספר פעמים לאורך הציר הארוך באמצעות הצד החיצוני של חצי אחד של זוג פינצטה בעדינות עד סיסית שבור פתוח אך להשאיר את העובר ב Chorיון הקליפה כדי למנוע התייבשות מהירה. המשך בתהליך זה עד 10-20 של הביצים טופל (תלוי במספר הביצים הנדרשים עבור ניסוי בודד).
3. העוברים יכולים להיות נטל להסיר קליפה סיסית והניח בעדינות אחד על רצועת דבק 1. הביצים יכול להיות ממוקם בציר או עם הצד הארוך מקביל העובר או אנטי מקביל לצד הארוך של רצועת דבק תלוי אם יש microinjected.
4. העוברים יכולים להיות מכוסה מיד עם כמות מתאימה של שמן 10s Voltalef (תערובת של שמן 05:01 Holocarbon 700 ו 27 שמן, סיגמא) על מנת למנוע התייבשות נוספת הדמיה מיידית או להציב בחדר התייבשות של 3-8 דקות מייבשים אותם עוד יותר, בהתאם לחות החדר, את מטרת הניסוי. עוברים את מיובשים צריך להיות מכוסה בשמן 10s בעת הצורך כדי למנוע התייבשות יתר microinjection אם נדרש. (ראה תרשים. 2 ג, ד& E).

6. הדמיה עוברים

1. תמונות זמן לשגות או אחת של עוברים חיים נאספים באמצעות TCS Leica SP2 מיקרוסקופיה הפוכה מערכת confocal עם PL HCX APO CS 40X אובייקטיבי 1.25 שמן טבילה (60 או מטרות 100x ניתן להשתמש גם בהתאם לצורך הניסוי, גבוה יותר הגדלה בשימוש תמונה יותר הלבנת תתרחש).
2. כאשר fluorophores הדמיה מרובים, אשר חופפים ספקטרום ו הם שיתוף לידי ביטוי העובר עם זאת, אורך גל אחד ניאון פליטת חלבון נאסף ברצף. את עירור ופליטה אורכי גל הזמינים מערכת TCS SP2 Leica הם: ה-GFP, λ _Ex: 488 ננומטר ו λ _Em: 500-600 ננומטר. RFP, λ _Ex: 543 ננומטר ו λ _Em: 555-700 ננומטר.
3. תמונה אחת הושג בדרך כלל עם ממוצע של 2 מסגרות סריקות כממוצע של 2 scanlines. זה לוקח מינימום של 6.3 שניות כדי לסרוק עמ '512x512התמונה ixel במצב סריקה בו זמנית, ו 15.44 שניות למצב סריקה סדרתית ומייצרת יחס טוב האות לרעש. בימים אלה צריכים להילקח בחשבון בעת ​​הגדרת מסגרות זמן לאיסוף זמן לשגות התמונה.
4. חריר נקבע בדרך כלל 1-2 יחידות אסטרונומיות (יחידה אוורירי), ואת כוח לייזר הותאם לרמה הנמוכה ביותר האפשרית כדי למנוע photobleaching משמעותי.

7. לעורר את SAC ידי Microinjecting את העוברים עם ריאגנטים מתאימים

1. הכן את המחט לפני הניסוי. אנחנו מעדיפים למשוך את המחט מתוך siliconised זכוכית נימים (GC-100-10, הרווארד) באמצעות בוערים / חום micropipette חולץ (סאטר, מכשיר דגם: P-97) עם פרמטרים: חום = 600, משוך = 90, לוול ךיב = 70 , דל = 150.
2. לגבות את המחט עם 1-2 מ"ל של הריכוז המתאים של מגיב במאגר באמצעות הזרקת עצה הטעינה בסדר (20 μl הרבה Eppendorf: W215818J).
3. הר מחט הו מחטlder על מיקרוסקופ עם צינור לחץ מחוברת מערכת בקרת הזרקה Eppendorf.
4. מצא את העובר תחת המטרה 40X ולמצוא צל המחט מבלי לשנות את מישור המוקד על ידי העברת המחט אל מרכז שדה הראייה ולאט לאט להוריד אותו למישור המוקד הנכון.
5. העבר את העובר בעדינות למצוא ריבוע קטן של coverslip שבור מראש רכוב בקצה אחד של רצועת דבק. בעדינות להזיז את קצה המחט עד שהיא פוגעת קצה coverslip ריבוע קטן ובעדינות שובר את זה פתוח.
6. להעביר את העוברים חזרה להציג ולבחור את העובר בגיל המתאים להזרקה. אני בדרך כלל להזריק את העובר על מחזור חלוקת הגרעיני 5-7 כמו זה לפני גרעינים נודדים החוצה אל קליפת המוח. מחזור בשלבים הגרעין חטיבת ניתן לקבוע על ידי סריקה מהירה של אותות ניאון של ה-GFP-Cdc20 או את האות גרעינית של 2 ב-RFP היסטון לפני הזריקה ^9.
7. בזהירות להעביר את embryo קרוב מחט ולתקן את המטוס מרחק של העובר והן את המחט. העבר את העובר אל המחט ולהזריק ירידה של מגיב למצב הרצוי, להעביר את העובר חוץ (או בצע את ההוראות עבור מערכת microinjection). העובר יהיה ניתן להזריק מ האחורי שלה או מהצד, בהתאם לצורך הניסוי.
8. מזריקים פעם אחת העובר מוכן להיות צילמו בזמן המתאים. (ראה תרשים 2F & G)

8. נציג תוצאות

באיור 1. החומרים הדרושים: א. עט מכחול דק, ב. מיכל קטן בכיכר שבורים משקפיים, ג. 22 x 50 מ"מ coverslip, ד. שקופיות מיקרוסקופ, דואר. דו צדדית קלטת F דביק. שמרים אבקת יבש מבחנה עם חורים על המכסה, גרם. שמריםגרעין משמש לצורך תחזוקה זבוב, ש. לטוס בקבוקון אוכל, אני. מחצית כמה פינצטה המשמשים עוברי dechorionate, j. כמה פינצטה זוג, k. heptane מיכל דבק נוזלי (בעדינות בקבוק מדידה).

איור 2. התרשימים מראים את הכנת את coverslips ושקופיות ב 4 אחר צעד, dechorionation העובר בשלב 5 וההכנות מחט עבור microinjection בשלב 7. . התמונה למעלה מראה coverslip עם רצועת דבק heptane פני התיכון שלה ריבוע קטן של coverslip שבור תקוע עד הסוף 1. התמונה התחתונה מראה שקופיות מיקרוסקופ עם שכבה דקה של מים על ארבע פינותיה להחזיק coverslip. הסיבה לשימוש שקופית להחזיק coverslip היא לשמור פחות או יותר את המרחק מרחק זהה לזה נמצא כאשר יש לך דו צדדית הסרט בשקופיות ובכך להימנע ממקדות מחדש את המיקרוסקופ בזמן שאתה ARדואר הניתוח, העברת עוברים בין הקלטת coverslip. ב. שקופית עם אורך קצר של סרט דו צדדית ויסקי הוחל לפני קילוף נייר העטיפה שלו משמש dechorionating העובר. C. התמונה משמאל מראה עוברים עם פצצות סיסית שלמים עם קצוות הקדמי וגם האחורי המסומנים: התמונה מימין מציגה את העוברים את הפגזים סיסית שבורים לפני שהם הועברו על coverslip עם רצועת דבק D & E תרשימים המראים 2.. דרכים להעברת, הצבת והתאמת עוברים dechorionated על פסי דבק. העוברים היו מכוסים על ידי שמן 10s לאחר תקופת יובש המתאים. F & G. תרשימים המראים איך לפתוח את קצה מחט ולמקם אותו על מנת להזריק.

תמונות בודדות או זמן לשגות שהתקבלו בניסויים שתוארו לעיל ניתן לנתח באופן ישיר באמצעות תוכנת Leica או לשמור קבצי TIF כמו FO פתוחrmat זמין כימות נוסף או ניתוחים באמצעות עריכת אחרים הנפוצים ניתוח התמונה תוכניות כמו תמונה J, Photoshop ו MetaMorph ועוד שתי דוגמאות כדי להמחיש זאת נדונים להלן:

דוגמה 1: הסרט זמן לשגות (איור 3) מראה את הגיוס kinetochore הדינמי של Cdc20-GFP ותנועה כרומוזום בחיים עוברים תסיסנית סינסיציאלי. אזור ריבית זמן לשגות תמונות מקוריות רצף היה נחוש / ערוך אצווה המרה אוטומטית באמצעות תוכנת פוטושופ. הסרט נערכו באמצעות תוכנת QuickTime.

איור 3. הסרט של צילום בהילוך מהיר מראה הגיוס kinetochore הדינמי של Cdc20-GFP ותנועה כרומוזום בחיים עוברים תסיסנית סינסיציאלי. (א) זמן לשגות התמונות נלקחו מעובר סינסיציאלי מהונדס שיתוף להביע GFP-Cdc20 (בירוק)RFP ו-2B היסטון (באדום) חלבונים היתוך ו נרשמו באמצעות מערכת TCS Leica SP2 confocal על 18 מעלות צלזיוס במהלך מחזורי החלוקה גרעיני 7-8. מסגרות נלקחו כל 10 שניות. מסגרת עם תאים שכבר prophase היא כאל נקודת זמן אפס ^10. לחץ כאן כדי להציג סרט איור 3 א (ב) ה-GFP-Cdc20 ניתן לצפות בקלות על prophase ו prometaphase kinetochores (B3 & 4, חצים לבנים) ו נמשכת על metaphase ו kinetochores anaphase (B5 & 6, חצים לבנים). GFP-Cdc20 נכלל שלבי הביניים גרעין (לבן ראש חץ), שנכנס לגרעין של prophase מוקדם. מורפולוגיות הכרומטין נקבעו באמצעות שיתוף ביטוי יתר His2BmRFP כסמנים (B8-14). ברים גוני 5 מ"מ.

דוגמא 2: פונקציות שק ניתן ללמוד על ידי מניפולציה של העוברים על ידי נוגדנים, חלבונים microinjecting שכותרתו fluorescently או chemicaL-תרכובות של עניין, כי פוטנציאל לעורר SAC. עבור קולכיצין למשל הזרקת כדי depolymerize את microtubules כדי להתגרות SAC כמצוין באיור 4 ^10.

באיור 4. Mad2 חיוני קולכיצין, מופעל פונקציה SAC ^10. GFP-cdc20; mad2 ^{+ / +,} GFP-cdc20; mad2 ^אי (mad2 ^{- / -} null מוטציה) ו-GFP mad2; mad2 עוברים ^אי טופלו על ידי קולכיצין microinjection. זמן לשגות תמונות confocal נלקחו לפני (01, 07 & 13) או לאחר ההזרקה (02-06, 08-12; הדף לוחות, לוחות הביניים, 14-18, לוחות למטה). GFP-Cdc20 (לוחות העליון באמצע) או GFP-Mad2 (הפאנל התחתון) אותות kinetochore שימשו מחזור סמנים סלולריים התקדמות. הפאנל העליון, החצים מצביעים על kinetochores שנעצרו 02-06. באזור המסומן בחץ ב 01 עולה כי לפני הטיפול קולכיצין, GFP-Cdc20 נכלל בגרעין שלבי הביניים המאוחרות. לוח התיכון, בהעדר Mad2 אנדוגני, GFP-Cdc20 אותות ממשיכים להתנדנד פנימה והחוצה של הגרעין, וכן הלאה וכן את kinetochores, אם כי cytokinesis נראה פגום, כפי שניתן היה לצפות עוברי חסר microtubules, בנוכחות של קולכיצין (מסומנת בחצים ב 07-12) דבר המצביע על תפקוד SAC לא הצליחו לעצור את התאים התגובה לטיפול קולכיצין. ההפרדה של גרעין הבת לא בתמונה 10. הפאנל התחתון, ראשי חץ ב 14-18 עולה kinetochores שנעצרו עם GFP-Mad2 שנצבר חלבונים היתוך להציע תפקודית GFP-Mad2 בהצלת פנוטיפ SAC פגם בעובר Mad2 מוטציה. ראש חץ של 13 מצביעה על GFP-Mad2 הצטברות בגרעין שלבי הביניים המאוחרות. בר = 5 מ"מ. העוברים היו microinjected עם נפח הביצה ~ 1% של פתרון המניות 100mg/ml קולכיצין של 1 X PBS.

Discussion

פרוטוקול המתוארת כאן היא שיטה גנרית עבור הדמיה לטוס עוברים סינסיציאלי באמצעות TCS Leica SP2 confocal מיקרוסקופ לייזר סורק והוא יכול להיות שונה כדי להתאים מערכות מיקרוסקופ אחרים, ויכול גם להיות מותאם ללמוד פונקציות גנים אחרים באמצעות עוברים תסיסנית סינסיציאלי. השתמשנו בפרוטוקול זה ללמוד היבטים רבים של המחסום ציר הרכבה, הדינמיקה חלבון proteolysis חלבון מהונדס באמצעות זבובים או נוגדנים polyclonal לדמיין לוקליזציה חלבונים בדגימות חיים או קבועים ^4,6,12-14.

היא הפשוטה ביותר לשמור על זבובים ב צלוחיות מזון טרי לטוס בעת איסוף מספר קטן (~ 10-100) של ביצים. פעולה זו מפחיתה את הטרחה של ביצוע והכנת נוספים אגר מיץ תפוחים צלחות איסוף בתאי ביצה כפי שמתואר בפרסומים אחרים ^15,16. תוספת של ריבוע קטן של זכוכית שבורה coverslip בקצה אחד של רצועת דבק על coverslip עושה את זה הרבה יותר קלכדי לפתוח את המחט לקבוע את עוצמת הזריקה באמצעות התאמת מערכת הגדרות microinjection תוך המחט הוא לטבול בשמן 10s. מידת התייבשות העובר חשוב להצלחה של הזריקה למניעת דליפות ושמירה על יכולת הקיום עוברים במיוחד עבור אלה ניסויים הדורשים תקופת זמן ארוכה או כאשר העלאת transformants לאחר ההזרקה. עם זאת, אין כלל הזהב עבור בדיוק כמה זמן נדרש התייבשות. פעולה זו שונה בין ניסוי לניסוי וגם תלוי בכמות של פתרון מוזרק והלחות של סביבת העבודה.

פונקציות של חלבון מסוים שמעניין ניתן להשפיע על ידי microinjecting מעכבי חלבונים ספציפיים, מונו או פולי משובט נוגדנים נגד חלבון מסוים, RNA שליח או פפטידים שכותרתו fluorescently תחת סוג בר או רקע מוטציה גנטית. רבים מאותם קווים מוטנטים או GFP-מתוייגים קווי מהונדס הם באב פומביתailable מ תסיסנית מניות מרכזי ורובם מפורטים על Flybase ( http://flybase.org/~~V ), ואפשר לחפש באינטרנט.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מרכיבים	משקל של	משאבים	הרבה לא.
תירס ארוחה	100.0g	SUMA, בריטניה
סוכר חום	50.0g	Billington של בריטניה
שמרים יבשים	25.0g	מת"ק שמרים בע"מ בבריטניה
אגר	12.5g	פישר סיינטיפיק	106556
Sorbic חומצה	0.4g	BDH, VWR אינטרנשיונל בע"מ בבריטניה	8829310
חומצה בנזואית	2.9g	פישר סיינטיפיק	1019599
Nipagin (Methyl-4-Hydro xybenzoate)	0.9g	BDH, VWR אינטרנשיונל בע"מ בבריטניה	K35969015
H 2 O עד 1 ליטר