Method Article
Кинетохора где SAC инициирует его сигнал контроля митотической сегрегации сестринских хроматид. Описан способ визуализировать набор и оборот одного из кинетохора белков и ее координации с хромосомой движения Drosophila Эмбрионов с использованием лазерного сканирования Leica конфокальной системы.
КПП шпиндельного узла (SAC) механизм активного сигнала, который контролирует взаимодействие между хромосомой кинетохоры и микротрубочки веретена, чтобы предотвратить наступление анафазы до хромосом подключены правильно. Клетки используют этот механизм для предотвращения анеуплоидия или геномной нестабильности и, следовательно, рака и других заболеваний человека, как врожденные пороки и болезни Альцгеймера 1. Число SAC компоненты, такие как Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Род и Aurora B киназы были определены, и все они кинетохора динамический белков 2. Опыт показывает, что кинетохора где сигнал SAC начинается. SAC премьер нормативных цель Cdc20. Cdc20 является одним из основных APC / C (P naphase romoting C или C омплекс yclosome) активаторов 3 и также кинетохора динамические белок 4-6. При активации SAC ингибирует активностьPC / C, чтобы предотвратить разрушение двух ключевых субстратов, циклин B и securin, тем самым предотвращая метафазы к анафазе переход 7,8. Точно, как сигнал SAC инициируется и собран на кинетохоры и передал на APC / C для подавления ее функции по-прежнему остается неуловимым.
Дрозофилы является чрезвычайно послушный экспериментальной системы, гораздо проще и лучше понятных организма по сравнению с человека, кроме одного, который разделяет фундаментальные процессы, в общем. Это, пожалуй, один из лучших организмов для использования био-визуальных исследований в живых клетках, особенно для визуализации событий митоза, в пространстве и времени, так как раннего эмбриона идет по 13 быстрых ядерных циклов деление синхронно (8-10 минут для каждого цикла при 25 ° С) и постепенно организует ядер в одном монослое только под корой 9.
Здесь я представляю био-изображений методом с использованием трансгенных Drosophila выраженияпоют GFP (зеленого флуоресцентного белка) или его вариант-целевых белков интереса и Leica TCS SP2 конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для изучения системы SAC функции мух, показывая изображение GFP слитых белков некоторых компонентов ЦОД, Cdc20 и Mad2 , в качестве примера.
1. Трансгенные мухи и обслуживание
2. Лети приготовления пищи (Лаборатория шкале)
3. Мелкое яйцо коллекции
4. Подготовка Покровные и слайды
5. Dechorionate эмбрионов
6. Изображения эмбрионов
7. Спровоцировать SAC по Microinjecting Эмбрионы с соответствующими реагентами
8. Представитель Результаты
Рисунок 1. Необходимые материалы:. штраф кисть, б. небольшой площади разбитого стекла контейнера, с. 22 х 50 мм, покровного, г. предметное стекло микроскопа, электронного. двусторонняя клейкая лента, ф. сухой порошок дрожжей в пробирку с отверстиями в крышке, г. дрожжигранулы для мух обслуживания, час. летать еда флаконе, я. половина пинцет для dechorionate эмбрионов, у. пару пинцет, к. гептан клей жидкости контейнер (мерную колбу).
Рисунок 2. Диаграммы показывают подготовки покровные и слайды в шаге 4, эмбрион dechorionation в шаге 5 и иглы подготовки к микроинъекции в шаге 7. . Верхняя картинка показывает, покровное с полосой гептан клей по всей средней и небольшой площади сломанной покровное застряли на одном конце. В итоге картина показывает стекле тонким слоем воды при ее четырех углов провести покровное. Причина для использования слайд провести покровное это держать примерно на том же расстоянии, как найти, когда у вас двухсторонний скотч на слайдах, и таким образом избежать переориентации микроскоп во время арэлектронной рассечения и передачи эмбрионов между лентой и покровное. B. Слайд с короткой длиной двусторонний скотч применяется до отшелушивающим обложке бумага, используемая для dechorionating эмбриона. C. На рисунке слева показан эмбрионы с неповрежденной оболочек хориона с выраженным передним и задним концами, картинка справа показывает эмбрионов в разбитая скорлупа хориона, прежде чем они были переведены на покровное с клеем полосы D и E диаграммы, показывающие два.. пути передачи, размещения и согласования dechorionated эмбрионов на клей полосы. Эмбрионы были покрыты маслом 10S после соответствующего периода высыхания. F и G. диаграммы, показывающий, как открыть кончик иглы и позиции, таким образом, чтобы инъекцию.
Одно-или замедленной изображений, полученных из описанных выше экспериментов может быть непосредственно анализировали с помощью программного обеспечения Leica или сохраняются в формате. TIF файлов, открытых лРМАТ для дальнейшего количественного анализа и редактирования с помощью других общий анализ изображения программ, таких как изображения J, Photoshop и т.д. метаморфизма два примера для иллюстрации этого приведены ниже:
Пример 1: временной промежуток фильма (рис. 3) показывает, динамический набор кинетохора из GFP-Cdc20 и хромосомные движения в живых дрозофил синцитиальный эмбрионов. Область интересов от оригинального покадровой последовательности изображений было определено / Под ред-и автоматизированных партия преобразуется с помощью Photoshop программного обеспечения. Фильм был собран с использованием QuickTime программного обеспечения.
Рисунок 3. Покадровой фильм показывает динамический набор кинетохора из GFP-Cdc20 и хромосомные движения в живых дрозофил синцитиальный эмбрионов. (A) Покадровый изображения были взяты из трансгенных эмбрионов синцитиальный совместного выражения GFP-Cdc20 (зеленый цвет)и RFP-гистонов 2B (в красном) белков слияния и были записаны с помощью Leica TCS SP2 конфокальной системе при 18 ° С при ядерных циклов деление 7-8. Кадры были сделаны каждые 10 секунд. Кадр с клетками уже в профазе рассматривается как нулевой момент времени 10. Щелкните здесь для просмотра фильмов на 3А . (B) GFP-Cdc20 можно легко наблюдать на профазы и прометафазе кинетохоры (B3 и 4, белые стрелки) и сохраняется на метафазе и анафазе кинетохоры (B5 и 6, белые стрелки). GFP-Cdc20 исключен из интерфазных ядер (белая стрелка), входящих в ядро в начале профазы. Хроматина морфологии определяли с помощью со-выраженный His2BmRFP в качестве маркеров (B8-14). Бары = 5мм.
Пример 2: SAC функции могут быть изучены с помощью манипулирования эмбрионов microinjecting антител, флуоресцентно меченых белков или Chemicaл соединений, представляющих интерес, который потенциально вызвать SAC. Например инъекционных колхицин в деполимеризоваться микротрубочек чтобы спровоцировать SAC, как показано на рисунке 4, 10.
Рисунок 4. Mad2 имеет важное значение для колхицина, вызванной функции SAC 10. GFP-cdc20; mad2 + / +, GFP-cdc20; mad2 Е.Ю. (mad2 - / - нулевой мутанта) и GFP-mad2; mad2 эмбрионов EY лечили колхицин методом микроинъекции. Покадровый конфокальной снимки были сделаны до (01, 07 и 13) или после введения (02-06, верхние панели, 08-12, средние панели, 14-18, нижняя панель). GFP-Cdc20 (высшего и среднего панели) или GFP-Mad2 (нижняя панель) кинетохора сигналы были использованы в качестве клеточных маркеров прогрессии цикла. Верхняя панель, стрелки указывают арестован кинетохоры в 02-06. Области отмечен стрелкой в 01 указывает, что до колхицина, GFP-CDC20 исключен из ядра конце интерфазы. Средние панели, в отсутствие эндогенного Mad2, GFP-Cdc20 сигналы продолжают колебаться в и из ядра, и на и от кинетохоры, хотя цитокинеза оказывается дефектной, как и следовало ожидать в отсутствие эмбрионов микротрубочки, в присутствии колхицина (указано стрелками на 07-12), что свидетельствует о не удалось SAC функции арест клеток в ответ на прием колхицина. Разделение дочернего ядра не удалось в картине 10. Нижняя панель, наконечники стрел в 14-18 показывают арестован кинетохоры с накопленными GFP-Mad2 белков слияния, чтобы предложить функциональные GFP-Mad2 в спасательных фенотип SAC дефект мутант Mad2 эмбриона. Arrowhead в 13 указывает GFP-Mad2 накоплением в ядре конце интерфазы. Бар = 5мм. Эмбрионы microinjected с ~ 1% яичного объем 100мг/мл маточного раствора колхицина в 1 х PBS.
Протокол, описанный здесь, является универсальным методом для работы с изображениями летать синцитиальный эмбрионов с использованием Leica TCS SP2 конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и может быть изменен в соответствии с другими системами микроскоп, а также может быть адаптирована для изучения других функций генов дрозофилы синцитиальный использованием эмбрионов. Мы использовали этот протокол для изучения многих аспектов контрольно-пропускном пункте шпиндельного узла, динамики белков и белков протеолиза использованием трансгенных мух или поликлональных антител для визуализации белка локализация в живых или фиксированных образцов 4,6,12-14.
Проще всего мух в свежих флаконах пищи лету, собирая небольшое количество (~ 10 - 100) яиц. Это снижает хлопот решений и подготовке дополнительных яблочного сока агаром и камеры сбора яиц, как это описано в других изданиях 15,16. Помимо небольшого квадратного битого стекла покровного на одном конце полосы клея на покровное делает его намного прощеЧтобы открыть иглу и определения объема впрыска, регулируя настройки микроинъекции системы, а игла погружения в масло 10С. Степень высыхания эмбрион имеет важное значение для успешного введения в предотвращении утечек и поддержания жизнеспособности эмбрионов, особенно для тех экспериментов, которые требуют длительного периода времени или при повышении трансформантов после инъекции. Однако, нет золотого правила, сколько времени высыхания требуется. Это зависит от эксперимента к эксперименту и зависит от количества раствора вводят и влажность рабочей среды.
Функции специфического белка интереса можно манипулировать microinjecting специфические ингибиторы белка, моно-или поли-клональных антител против специфического белка, РНК или флуоресцентно меченых пептидов в дикого типа или генетической мутации фона. Многие из этих мутантных линий или GFP с метками трансгенных линий публично пр.ailable от дрозофилы фондовых центров и большинство из них котируются на Flybase ( http://flybase.org/~~V ) и может быть найден в Интернете.
Нам нечего раскрывать.
Этот протокол был разработан в рамках Wellcome Trust грант. Мы благодарим г-жа Морин Sinclair для поддержания лету запасов и подготовке лету пищу на протяжении многих лет. Мы также хотели бы поблагодарить г-на Майкла Aitchison за помощь и техническую поддержку в разработке этого протокола.
Необходимое оборудование и реактивы:
Конфокальной системы визуализации: изображение системы, описанной в этом протокол Leica TCS SP2 лазерной сканирующей конфокальной микроскопии перевернутой системе. Описанный метод также подходит, возможно, с некоторыми незначительными изменениями для других систем визуализации.
Анатомический микроскоп: Мы используем Olympus SZX7 с DF PLAPO 1X-4 объектива.
Иглы съемник: Горячие / коричневый микропипетки съемник (от Саттер инструмент, модель: Р-97).
Микроинъекция системы: система Эппендорф микроинъекции описано, но любая другая соответствующая система может быть использована.
Лети дистрибьютор продуктов питания: Jencons научно ООО перистальтического насоса.
Реагенты:
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ингредиенты | Весс | Ресурсы | Лот № |
Кукурузной муки | 100,0 г | SUMA, Великобритания | |
Коричневый сахар | 50.0g | Биллингтон, в Великобритании | |
Сухие дрожжи | 25.0g | DCL дрожжей ООО Великобритании | |
Агар | 12.5g | Fisher Scientific | 106556 |
Сорбиновая кислота | 0,4 г | BDH, VWR International ООО Великобритании | 8829310 |
Бензойная кислота | 2.9g | Fisher Scientific | 1019599 |
Нипагин (Метил-4-Hydro xybenzoate) | 0.9g | BDH, VWR International ООО Великобритании | K35969015 |
H 2 O до 1л |
Holocarbon 700 и 27 Масла приобрести Sigma.
Сухие дрожжи: Томас Эллисон, Великобритания.
Подготовка гептан клея: Возьмите около 1,5 метров двухсторонний скотч, положите его в 15 мл трубку Сокол с 5 мл гептана и вращать в течение 3-5 часов или на ночь. После этого разделить на 4 равные порции в пробирки на 1,5 мл Eppendorf центрифугу и крутить в течение 5 мин на высокой скорости в настольные центрифуги для удаления мусора. Хранить раствор клея гептана в 10 мл мерную колбу и сохранить для использования. Клей сила будет варьироваться в зависимости от концентрации и количества клея. Как правило, чем тоньше клей производит меньше шумовой фон при сканировании с помощью конфокальной микроскопии.
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены