דגם Murine של אימון שרירים באמצעות גירוי חשמלי neuromuscular

Summary

מודל murine של גירוי חשמלי neuromuscular (NMES), שיטת קליני בטוח ולא יקר, אל השרירים תא הקדמי מתואר. מודל זה יש את היתרון של שינוי התקן קליני זמינים לצורך לעורר התכווצויות שרירים ממוקד וספציפי בעכברים.

Abstract

גירוי חשמלי neuromuscular (NMES) היא שיטת קליני נפוץ בשימוש נרחב להחזיר ^{1, 2} לשמור או לשפר ^3-5 קיבולת שרירים פונקציונלי. גירוי משטח Transcutaneous של שרירי השלד כולל זרימת הנוכחי בין הקתודה לבין האנודה, ובכך גרימת ההתרגשות של יחידת המנוע סיבי השריר שמסביב.

NMES היא שיטת אטרקטיבי כדי להעריך את התגובות שריר השלד הסתגלות מכמה סיבות. ראשית, הוא מספק מודל ניסיוני לשחזור בו התאמות פיזיולוגיות, כגון hypertophy myofiber וחיזוק שרירים ^6, אנגיוגנזה ^{7-9, 9-11} הפרשת גורם הגדילה, ו מבשר שריר תא הפעלת ¹² מתועדים היטב. התגובות הפיזיולוגיות כאלה ניתן טיטרציה בזהירות באמצעות פרמטרים שונים של גירוי (Cochrane לבדיקה, לראות ^13). בנוסף, NMES המגויסיםיחידות המנוע הלא סלקטיבי, ובאופן קבוע במרחב ואת סינכרוני temporally ^14, מציע את היתרונות של הפעלת השפעה על הטיפול סיבי כל, ללא קשר לסוג סיבים. אמנם יש התוויות נגד שצוינו NMES באוכלוסיות קליניות, כולל הפרעות ורידיים הפריפריה או גידול ממאיר, למשל, NMES הוא בטוח ריאלי, אפילו עבור אלה אשר חולים ו / או מרותק למיטתו ועל אוכלוסיות שבהן פעילות גופנית קפדנית יכול להיות אתגר.

הנה, אנחנו מדגימים את פרוטוקול התאמת האלקטרודות זמינים מסחרית וביצוע פרוטוקול NMES תוך שימוש במודל murine. מודל זה בעל חיים יש את היתרון של שימוש במכשיר זמין קלינית ומתן משוב מיידי לגבי המיקום של האלקטרודה לעורר את האפקט הרצוי שרירים כויץ. לצורך כתב יד זה, נתאר את פרוטוקול לגירוי שרירים של שרירי תא הקדמי של hindlimb העכבר.

Protocol

1. אלקטרודה הכנה

• חותכים 1 ס"מ x 1 ס"מ בחלק של המעגל וקטור.
• לייצב 2 סיכות wirewrap באמצעות אחיזה סגן, עם סיכות במרווחים של כ 3.5 מ"מ זה מזה. את הקצוות מפוצלת של הפינים יש פונה כלפי מעלה.
• לכופף wirewrap סיכות בזווית 90 מעלות, כ באמצע הדרך לאורך שלהם, באמצעות צבת נידלנוז.
• לחשוף את חוטי נחושת של מחברים, כ 7 ס"מ מחיבור עופרת, על ידי הפשטת בידוד תיל.
• הלחמה אחת חוטי נחושת עד הסוף מפוצלת של אחד הפינים wirewrap. חזור על שלב ההלחמה של סיכה wirewrap אחר.
• משוך לכווץ צינורות על החיבור מולחם בין חוטי נחושת וסיכות זהב כדי לבודד ולייצב. מחממים את צינורות באמצעות קצה הלחמה.
• הכנס את הטיפים unsoldered של wirewrap סיכות לתוך פתחים סמוכים של המעגל קרש החיתוך.
• להבטיח את הסיכות wirewrap מקבילים זה לזה רחובאיכס באמצעות קרש החיתוך כך את הטיפים נמצאים באותו מרחק כאשר הניח את הלוח.
• שבץ קצוות מולחמים של סיכות אפוקסי ברור. אפשר אפוקסי לרפא כ 10 דקות, או עד לייבוש מלא.
• חזור על היישום של אפוקסי עד סיכות המעגלים וקטור מוטבעים לחלוטין על מנת לספק שלמות מבנית והקלה על מתח החוטים מובילים.
• חול למטה אפוקסי באמצעות קובץ מתכת לחשוף את קצות הפינים זהב.
• השתמש מודד על מנת להבטיח את שתי הפניות לא לקצר חשמלי וכי החוטים מובילים יש המשכיות ראויה
• חבר את האלקטרודה מוביל מהמכשיר NMES למחבר 2-way נקבה חוט (כבל פומונה תיקון).

2. בעלי חיים הכנה

• בעלי חיים מורדמים באמצעות שאיפת באמצעות isofluorane 2% (Abbott Laboratories, צפון שיקגו, אילינוי) ב 100 הגז O _2%. בעל חיים צריך להישאר בהרדמה ברחבי tהוא NMES הפגישה.
• לפני שמתחילים לבצע פרוטוקול NMES קמצוץ הבוהן על מנת להבטיח כי בעל החיים הוא מורדם לחלוטין.
• בעלי חיים צריך להיבדק באופן קבוע על מנת להבטיח את רמת ההרדמה היא מספיק בתגובה לגירוי. הרדמה יש להתאים לפי הצורך. תנועה חוץ מזה של הרגל מגורה, שינויים עומק הנשימה, צבע ריריות צריכים להיבדק באופן קבוע כדי לפקח על עומק ההרדמה.
• מקם את החיה שכיבה לרוחב.
• החל סיכה עיניים לעיניים, כדי למנוע התייבשות הקרנית במהלך ההליך.
• לגלח את האזור hindlimb לקבל טיפול, ולנגב עם אלכוהול.
• נגב את האלקטרודה עם אקונומיקה 3%, ולאחר מכן לשטוף עם מים.
• למרוח שכבה של מנהלים ג'ל על האתר שבו האלקטרודה יחולו. להחיל מחדש לפי הצורך בכל פרוטוקול NMES כדי להבטיח זרימת הנוכחי בין האלקטרודה ואת העור.
• חום מנורת Or שמיכה במחזור המים יש להשתמש כדי לשמור על נורמליות בגוף טווחי הליבה.
• הערה: כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי טיפול אוניברסיטת פיטסבורג בעלי חיים מוסדי ועדת שימוש והופיע PHS מובטח ויש AAALAC int. תוכנית מוסמך ומתקנים.

3. גירוי

• אלקטרודה מיקום:
  • על גירוי של השרירים תא הקדמי, כולל הקדמי tibialis ואת השרירים longus extensor digitorum, למקם את האלקטרודה פני השטח באופן ישיר על העצב שוקיתי עמוק של בעל החיים, שהוא סניף דיסטלי את העצב peroneal משותף, והוא ממוקם קדמית רק כדי שוקיתי הראש.
  • על גירוי של השרירים תא הקדמי, מיקום האלקטרודה הוא אישר כאשר גירוי מעורר dorsiflexion הקרסול מלא והסיומת מלא הספרות. מצד שני, dorsiflexion, בהעדר סיומת ספרות עולה כי רק אנטה tibialisשרירים rior נמצא מגורה. תגובה כזו כויץ ממוקד יכול להיות רצוי, בהתאם לעיצוב המחקר.
  • התכווצות השריר מחולק 2 שלבים: שלב של גירוי חינם מרגש, קונצנטרי, אשר מתרחשת במהלך הראשוני ~ 0.5 שניות. בשלב ראשון זה, כפה עובר ממצב מנוחה כדי dorsiflexion מירבית סיומת ספרות. השלב השני של גירוי הוא כיווץ איזומטרי שעברנו dorsiflexion מקצה טווח סיומת ספרות.
• גירוי פרמטרים:
  • מודל זה מנצל NMES 300 PV Empi מכשיר תכליתי בחשמל, המספק 2 ערוצי NMES קונבנציונאלי (ראו טבלה). לצורך מודל זה, רק ערוץ 1 משמש.
  • הפרמטרים המשמשים כוללים צורת גל סימטרי, משך הדופק של 150 μs ואת תדירות 50Hz. בזמן גירוי מוגדר 5 שניות, עם עד 0.5 הרמפה השנייה כבש 0.5 2 למטה. זה יאפשר לשריר יותר בהדרגה accliחבר לגירוי. בפרוטוקול הנוכחי, את הזמן בין הצירים נקבע ל -10 שניות, אבל זה עשוי להיות מותאם בהתאם לפעילות הרצויה. ירידה הזמנים תגרום ייזום מהירה יותר של עייפות שרירים. פרמטרים אלה גירוי התבססו על פרוטוקולים קליניים שנועדו לשפר את כוח השרירים באמצעות גירוי חשמלי neuromuscular, ללא גרימת נזק משמעותי בשריר השלד ^{1, 15, 16.}
  • עכברים להשלים שתי קבוצות של 10 צירים, עם כל 5 דקות בין סטים.
  • בעלי חיים בוגרים, עוצמת NMES היא יזמה בדרך כלל mA 9. מניסיוננו, זה בערך לעוצמת החל מקסימלי זה לא לגרום פגיעה בהליכה מורגש מיד לאחר הגירוי. עבור הפעלות NMES הבאים, עוצמת גדל ב 1 mA בכל פעם החיות יכולים להשלים 20 dorsiflexions מלא.
• בעקבות השלמת גירוי פרוטוקול recoמאוד מן ההרדמה, בעלי חיים בדרך כלל להפגין הליכה יציבה תקינה. ההליכה צריך להישאר נפגמה לכל אורך התוכנית NMES.

4. נציג תוצאות

פרוטוקול NMES המתוארת במאמר זה יושם על זני עכברים שונים, וביניהם: סוג Wild (B6/10), B6.SCID MDX ו / עכברי SCID. תוצאות נציג של NMES שבוצעו במהלך 4 שבועות (20 מפגשים) ב 3-5 חודשים בן MDX / SCID מוצגים.

החיות היו מורדמים אנושי על ידי צוואר הרחם בזמן העקירה בהרדמה. השריר הקדמי tibialis היה לקצור ולהקפיא מיד ג 2 מתיל בוטאן מראש מקורר בחנקן נוזלי, ומאוחסנים ב -80 ° טורי חתכים (10 מיקרומטר) התקבלו ו מותקן על גבי שקופיות. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תקן חבילות תוכנה סטטיסטית (SPSS, v19.0 תוכנה). ראשית, המבחן של לוין שימש כדי להעריך אם יש WAשל שוויון שונויות. מדגמים בלתי תלויים מבחן t נערך אז לחקור את ההבדלים בין NMES וקבוצות בקרה.

Hematoxylin ו Eosin (H & E) כתמים בוצעו כדי לבדוק האם פרוטוקול NMES יביא לפגיעה מוגברת בשריר dystrophic. חלק אחד נבחר, ותמונות התקבלו באמצעות מיקרוסקופ אור (Nikon Eclipse E800, ניקון, יפן). המספר הכולל של סיבים ומספר סיבי עם גרעינים במיקום מרכזי נספרו באופן ידני באמצעות המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH) - פיתחה תוכנה לניתוח תמונה, תמונה ג'לא היתה עלייה משמעותית במדד התחדשות (מספר סיבי גרעיני מרכזי / המספר הכולל של סיבים) של בעלי החיים שהוגשו NMES, בהשוואה לקבוצת הביקורת (p = 0.802, איור 1). הדבר מצביע על כך את היישום של NMES אינו מעלה את מפל ניוון-התחדשות נצפתה אצל בעלי חיים dystrophic, ולכן לא סבירלהיות גרימת פציעה בשריר מוגברת.

מכתים Immunofluorescent עבור CD31 בוצע כדי לחקור את ההשפעה של פרוטוקול NMES 4 שבועות על כלי הדם בשריר. בקצרה, שרירים חלקים תוקנו ב 4% פורמלין וחסמו באמצעות סוס 5% סרום (HS). סעיפים היו מודגרות עם נוגדנים נגד עכברוש העכבר הראשי (1:300 דילול ב HS 5%) מטופלים עם נוגדנים 555-שכותרתו עז נגד עכברים משני (1:300 דילול ב HS 5%). כדי לכמת את המספר הכולל של תאים CD31 חיובי, חלק אחד נבחר, וצילם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Nikon Eclipse E800, יפן). המספר הכולל של הנימים נמנה באופן ידני באמצעות צפון Eclipse תוכנה (Empix הדמיה בע"מ). חלה עלייה משמעותית במספר CD31 בתאים חיוביים בעלי החיים שהוגשו NMES בהשוואה לקבוצת הביקורת (p <0.01, איור 2), המציין את הפרוטוקול NMES כמתואר מעודד היווצרות כלי דם בשרירי השלד.

בבדיקה situ כויץ: ארבעה שבועות לאחר סיום פרוטוקול NMES, בדיקות התכווצות של שרירי תא הקדמי בוצעה באמצעות מנגנון בדיקה באתרם (דגם 809B, אורורה מדעי Inc, קנדה), ממריץ (דגם 701C, אורורה מדעי Inc , קנדה), וכוח מתמר (אורורה מדעי Inc, קנדה). בקצרה, עצב peroneal בעלי חיים הרדים היה מבודד דרך חתך קטן לרוחב כדי לברך. עכברים הונחו אז פרקדן על משטח מוגבה, רגל למבחן היה ממוקם על מדרגת. Hindlimb המשמש לבדיקות התייצב עם סרט בד על הברך וכף הרגל. השרירים היו מגורה באמצעות מספר אלקטרודות וו מוכנס מתחת לעור. התכווצות שרירים tetanic נבדק בתדר של 150Hz עבור 350ms לבדוק האם פרוטוקול 4 שבועות NMES תגרום לשיפור כוח השרירים. התוצאות היו מנורמל משקל שריר רטוב. חלה עלייה של 30% בערך tetanהתכווצות IC בעלי חיים שהוגשו NMES, בהשוואה לקבוצת הביקורת (p = 0.005) (איור 3), דבר המצביע על פרוטוקול תיאר משפר את חוזק שרירי השלד ב MDX / SCID בעלי חיים.

. איור 1 Hematoxylin & Eosin מכתים שלד שריר dystrophic (MDX) / עכברים immunodeficient (4-5 חודשים) (הגדלה פי 10): א) שולטת ללא טיפול, ב ') לאחר 4 שבועות של NMES.

איור 2. CD31 immunofluorescence (אדום), כסמן של כלי הדם בשרירי השלד, בשריר השלד של dystrophic (MDX) / עכברים immunodeficient (4-5 חודשים) (20x בהגדלה) A) שולטת ללא טיפול, ב ') לאחר 4 שבועות של NMES.

איור 3. בדיקות כויץשל שרירי תא הקדמי בשליטה חיות שטופלו NMES למשך 4 שבועות. mNm = מילי מטר ניוטון. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

Discussion

התוצאות מראות כי המודל Murine מפותחת שלנו NMES מעודד היווצרות כלי דם בשרירי השלד (איור 2) וחיזוק (איור 3), אך לא לגרום נזק שרירי השלד (איור 1).

יש לציין כי הפרמטרים גירוי המתוארים כאן עוצבו כדי לגרום שרירים עומס יתר על שרירי תא הקדמי. בדיוק כמו במקרה של תרחישים קליניים, מיקום האלקטרודה עשוי להיות מותאם כדי לעורר את קבוצות השרירים האחרות, אם כי התגובה שריר NMES עשויים להיות שונים, בהתאם לסוג הרכב סיבים. NMES משך הזמן, המספר הכולל של טיפולים, והמספר הכולל של חזרות ניתן לשנות לפי ללמוד עיצוב.

כמו עם כל פרוטוקול, שיטה זו יש מגבלות, כי יש לציין. במחקר הנוכחי, גירוי בוצע על העצב שוקיתי עמוק. עם זאת, במרפאה, גירוי אניזה מנוהל בדרך כלל על יחידת המנוע. במודל חיה, גירוי של העצב ידרוש עוצמה נמוכה יותר כדי לעורר התכווצות שרירים מלא. מגבלה נוספת של המודל כפי שהוצגה היא כי איננו יכולים לקבל מידע לגבי רמת הנוחות במהלך היישום של NMES, שכן בעלי החיים מורדמים. לכן, והסבילות של בעוצמות דומות באוכלוסייה קליני קשה להעריך. עם זאת, תוצאות היסטולוגית שלנו מציעים מודל NMES שלנו, כפי שתואר, לא לגרום לפגיעה בשרירים.

פיתוח מודלים בעלי חיים המחקים את שיטות מיושם בדרך כלל במרפאה לספק לנו כלים שימושיים מעבדה המאפשרת הבנה משופרת של תגובות תאית ומולקולרית התערבויות טיפוליות. בנוסף, מודלים כאלה שימושיים לערוך מחקרים קדם קליניים הן לחדד פרוטוקולים השיקום הקיימים ולפתח סימנים חדשים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
תיל וקטור לעטוף ההודעה עם מסוף הלחמה מפוצלת	ניוארק	T68
וקטור המעגלים	ניוארק	3662-2
פומונה תיקון כבל	ניוארק	P-36-0
5 דקות אפוקסי	VO בכר ושות'	4001
ספקטרה 360 ג'ל אלקטרודה	Milliken רפואי	MR41217
ניידת גירוי neuromuscular המכשיר	EMPI	300pv