神経筋電気刺激による筋力トレーニングのマウスモデル

要約

前部コンパートメントの筋肉への神経筋電気刺激（NMES）、安全かつ安価な治療モダリティのマウスモデルは、記載されています。このモデルは、マウスでターゲットを絞った特定の筋肉の収縮を誘発する目的のために容易に利用可能な臨床デバイスを変更できるという利点があります。

要約

神経筋電気刺激（NMES）が広く^2を維持したり^、3月5日筋肉機能的能力を向上させ^、1を復元するために使用される一般的な臨床検査法の一つである。骨格筋の皮の表面の刺激、それによってモータユニットとその周辺の筋線維の興奮を誘発し、カソードとアノード間の電流の流れが含まれます。

NMESは、いくつかの理由により骨格筋の適応応答を評価するための魅力的なモダリティである。最初に、そのような筋線維hypertophyや筋肉の強化^6、血管新生^7-9、成長因子の分泌^9-11、および筋前駆細胞の活性化¹²のような生理的な適応は、十分に文書化された再現可能な実験モデルを提供しています。このような生理的反応は、慎重に刺激の異なるパラメータを（コクラン·レビューのために^、13を参照） ^を使用^して滴定することができます。さらに、新兵をNMES運動単位の非選択的及び空間的に固定されており、時間的に同期的に¹⁴で、すべての繊維上の治療効果を発揮するという利点を提供し、関係なく、繊維の種類。末梢静脈疾患や悪性腫瘍などの臨床集団におけるNMESに指定された禁忌がありますが、例えば、NMESは病気、そして/または、寝たきりの人のために、厳密な運動が挑戦されるかもしれない集団に対しても、安全で実現可能である。

ここでは、市販の電極を適応させるとマウスモデルを使用してNMESプロトコルを実行するためのプロトコルを示しています。この動物モデルは、臨床的に使用可能なデバイスを利用し、必要な筋肉の収縮効果を引き出すための電極の位置については即​​座にフィードバックを提供するという利点があります。本稿の目的のために、我々はマウスの後肢の前方コンパートメントの筋肉の筋肉を刺激するためのプロトコルについて説明します。

プロトコル

1。電極の調製

• ベクトルの回路基板の1cm X 1cmのセクションをカットします。
• 約3.5ミリメートル間隔をあけピンと副グリップを使用して、ピンをwirewrap 2を安定させる。ピンの分岐端部は上向きにする必要があります。
• ラジオペンチを使用して、約半分、その長さに沿って、90°の角度でピンをwirewrap曲げる。
• ワイヤの絶縁被覆を除去することで、コネクタ、リード線の接続から約7cmの銅線を公開します。
• 1 wirewrapピンの分岐端にハンダ銅線のいずれかを。他のwirewrap端子のはんだ付けの手順を繰り返します。
• 絶縁して安定させるために、銅線と金色のピンの間に半田付け接続部収縮チューブを引き出します。こて先を使用してチューブを加熱する。
• ブレッドボード回路基板の隣接した開口部にwirewrapピンの未はんだのヒントを挿入します。
• wirewrapピンが互いに平行とstであることを確認してくださいボードを介して配置したときのヒントは、同じ距離に位置しているようなブレッドボードを介して嫌なもの。
• 透明エポキシのピンのはんだ付け端を埋め込むことができます。エポキシ樹脂は、約10分間、または完全に乾燥するまで治療することができます。
• ピンとベクトルの回路基板が完全にリード線の構造の整合性とストレインリリーフを提供するために埋め込まれているまで、エポキシ樹脂の適用を繰り返します。
• 金のピンの先端を露出させる金属製のファイルを用いたエポキシダウン砂。
• 2本のリード線は電気的に短絡されておらず、リード線は、適切な継続性を持っていることを保証するためにマルチメータを使用して、
• 電極女性2ウェイ·ワイヤコネクタ（ポモナパッチ·コード）にNMESデバイスからリードを接続します。

2。動物の準備

• 動物は、100％O ₂ガス中で2％イソフルラン（アボット·ラボラトリーズ、ノースシカゴ、IL）を用いて吸入麻酔をかけています。動物はtを通して麻酔ままです彼はセッションをNMES。
• NMESプロトコルを開始する前に、動物は完全に麻酔であることを確認するためにつま先のピンチを実行します。
• 動物は、定期的に麻酔薬が十分に確保するために、刺激に対する応答を確認する必要があります。必要に応じて麻酔を調整する必要があります。刺激された足、呼吸の深さの変化、粘膜の色以外の運動はすべての麻酔深度を監視するために定期的に評価されるべきである。
• 横臥の動物を配置します。
• 手順の実行中に角膜の乾燥を防ぐために、目に点眼潤滑剤を適用します。
• 扱われるように後肢領域を剃ると、アルコールで拭いてください。
• 水で洗い流した後、3％の漂白剤で電極を拭いてください。
• 電極が適用されるサイト上にゲルを実施する層を適用します。電極と皮膚の間の電流の流れを確保するためにNMESプロトコルを通じて、必要に応じて適用します。
• 熱ランプOrの循環水の毛布は、通常のコア体の範囲を維持するために使用されるべきである。
• 注：すべての手順を見直し、承認されたピッツバーグ大学の動物実験及び利用委員会と保証PHSとAAALAC intに行われてきた。認定プログラムと施設。

3。刺激

• 電極配置：
  • 前脛骨筋と長指伸筋を含む前部コンパートメントの筋肉の刺激は、直接総腓骨神経の遠位枝オフになっている動物の深腓骨神経、上の表面電極を配置し、前方にちょうど位置しています腓骨頭。
  • 刺激が完全な足関節背屈と桁の完全な拡張子を引き出した際に前部コンパートメントの筋肉を刺激するために、電極の配置が確認されています。一方、桁の内線番号がない場合の背屈は、唯一の脛骨アンティことを示唆しているrior筋肉が刺激されています。このようなターゲットを絞った収縮反応は、研究デザインに応じて、望ましいかもしれません。
  • 初期〜0.5秒の間に発生した自由な移動、同心円状の位相：筋収縮は、刺激の2つのフェーズに分かれています。この最初のフェーズでは、足は最大背屈と桁の内線番号に安静時の位置から移動します。刺激の第2フェーズでは、エンドレンジ背屈と桁の内線番号での持続的な等尺性収縮である。
• 刺激パラメータ：
  • このNMESモデル（表を参照）、従来のNMESの2チャンネルを提供しています300 PV EMPI複合機エレクトロデバイスを利用しています。このモデルの目的のために、1チャンネルのみが使用されます。
  • 使用されるパラメータは対称波形、150μsのパルス幅と50Hzの周波数が含まれています。刺激時間は0.5秒のランプアップおよびランプダウン0.5秒で、5秒に設定されています。これは筋肉がより徐々にaccliできるようになります刺激メイト。現在のプロトコルでは、収縮の間のオフ時間は10秒に設定されていましたが、これは望ましい効果に応じて調整することができます。オフタイムの減少、筋肉の疲労のより迅速な開始になります。これらの刺激のパラメータは、重要な骨格筋の損傷^{1、15、16を}誘導^することなく、神経筋電気刺激を用いた筋力を強化するために設計された臨床プロトコルに基づいていた。
  • マウスは、セット間の5分間の休憩で、10の収縮の二組を完了します。
  • 大人の動物については、NMESの強度は、通常、9ミリアンペアで開始されます。我々の経験から、これは刺激の直後に顕著な歩行障害を誘発しない最大の出発強度におおよそのものです。その後のNMESセッションでは、強度が1ミリアンペアで動物は20個のフルdorsiflexionsを完了することができるたびに増加します。
• 刺激プロトコルとRECOの完了後非常に麻酔から、動物は一般的に通常の歩行と姿勢を示しています。足取りはNMESプログラムの期間中、障害がなく維持する必要があります。

4。代表的な結果

野生型（B6/10）、B6.SCIDおよびMDX / SCIDマウス：この資料に記載されているNMESプロトコルを含むいくつかのマウス系統で実装されています。 MDX / SCID古い3から5ヶ月で4週間（20セッション）上で実行NMESの代表的な結果が表示されます。

動物は人道的に麻酔下ながら頸椎脱臼により安楽死させた。前脛骨筋は、2 - メチルブタン液体窒素で事前に冷却し、-80℃で保存で収穫し、直ちに凍結させたシリアルクロスセクション（10μm）を取得し、スライド上にマウントされた。統計分析は、標準的な統計ソフトウェアパッケージ（SPSS、v19.0ソフトウェア）を用いて行った。最初に、レーベンのテストはそこでWAかどうかを評価するために使用されたの分散の平等。独立したサンプルのt検定は、その後NMESとコントロール群間の差を調べるために行われた。

ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）汚れはNMESプロトコルがジストロフィー筋で増加した傷害につながるかどうかを調べるために行われた。つのセクションが選択され、写真は光学顕微鏡（ニコンエクリプスE800、ニコン、日本）を用いて得られた。再生指数の有意な増加が（一元的に核線維の数はありませんでした開発した画像解析ソフトウェア、イメージJ. - 繊維や中心部の核​​を有する繊維の数の合計数は、手動で国立衛生研究所（NIH）を用いてカウントした繊維/総数）NMESに提出された動物では、などのコントロール（P = 0.802に比べて、 図1）。これは、NMESのアプリケーションがジストロフィーの動物で観察された変性·再生のカスケードを増加させないことを示唆しているため、そうではありません増加した筋肉の損傷を誘発することができます。

CD31のための免疫蛍光染色は、筋肉の血管に4週間NMESプロトコルの効果を調べるために行われた。簡単に言えば、筋肉のセクションは4％ホルマリンで固定し、5％ウマ血清（HS）を使用してブロックした。セクションは、ラット抗マウス一次抗体（5％HSで1:300希釈）と共にインキュベートし、555標識ヤギ抗ラット二次抗体（5％HSで1:300希釈）で処理した。 CD31陽性細胞の合計数を定量化するために、一つのセクションを選択し、蛍光顕微鏡（ニコンエクリプスE800、日本）を使用して撮影しました。毛細血管の合計数が手動で北Eclipseのソフトウェア（Empixイメージング社）を用いて計数した。 NMESプロトコルとして骨格筋の血管新生を促進し説明したことを示す、コントロール（図2のP <0.01）に比べNMESに提出された動物のCD31陽性細胞数の有意な増加がありました。

現場収縮試験で以下の四週間NMESプロトコルが完了した後、前方のコンパートメントの筋肉の収縮試験は 、in situ試験装置（モデル809B、オーロラ科学社、カナダ）、刺激（モデル701C、オーロラ科学社で使用して行った。 、カナダ）、力変換器（オーロラ科学社、カナダ）。簡単に言うと、麻酔動物の腓骨神経は膝の外側の小さな切開口から単離した。マウスは、プラットフォーム上で仰臥位に置かれた、テストされている足底板上に配置されました。テストに使用される後肢を膝や足に布テープで安定化させた。筋肉が皮膚の下に挿入されたフック電極を用いて刺激した。筋強直性収縮は、4週間のNMESプロトコルは筋力の改善を誘導するかどうかを調べるために350ミリ秒のために150Hzの周波数でテストされています。結果はぬれた筋肉の重量に正規化した。 tetan約30％の増加があった記述されているプロトコルを示唆しているコントロール（P = 0.005）（ 図3）に比べNMESに提出された動物のICの収縮は、MDX / SCID動物の骨格筋の強さを向上させます。

NMESの4週間後）に未処理の対照、B）： 図ジストロフィーの1ヘマトキシリン＆エオジン骨格筋染色（MDX）/免疫不全マウス（4-5ヶ月）（10×倍率）。

図2ジストロフィーの骨格筋（MDX）/免疫不全マウス（4-5ヶ月）（20倍の倍率）A）未処理のコントロールの骨格筋血管のマーカーとして、CD31免疫蛍光（赤）、B）の4週間後NMES。

図3収縮試験4週間NMESで処理した対照と動物の前部コンパートメントの筋肉。カタログ掲載=ミリニュートンメートル。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

ディスカッション

これらの結果は、NMESの我々の開発したモデルマウスは、骨格筋の血管新生（ 図2）高強度化（ 図3）を促進するが、骨格筋の損傷（ 図1）を誘発しないことを示唆している。

それはここで説明する刺激パラメータが前方コンパートメントの筋肉に過負荷を筋肉を誘導するように設計されていることに留意すべきである。臨床シナリオのケースがそうであるように、電極の配置は、NMESに筋肉の応答は繊維の種類組成に応じて、異なるかもしれませんが、他の筋群を刺激するように調整することができる。 NMES期間、治療セッションの合計数、および繰り返しの合計数は、デザインを学びに応じて変更されることがあります。

任意のプロトコルと同様に、このメソッドは、留意すべき制限があります。本研究では、刺激は深腓骨神経を介して行われた。しかし、クリニックでは、刺激Isは一般的にモータユニットで投与する。動物モデルでは、神経の刺激は、完全な筋収縮を誘発するために、低い強度を必要とするであろう。提示されたモデルのもう一つの制限は、私たちは動物が麻酔をかけていることを与えられたNMESの適用中に快適さのレベルに関する情報を入手することができないということです。したがって、臨床の人口に匹敵する強度の忍容性を評価するのは困難です。しかし、我々の組織の結果は説明したように、筋肉の損傷を誘発しない、私たちのNMESモデルを示唆している。

一般診療所で実装された様式を模倣する動物モデルの開発は、治療介入の細胞および分子応答の理解の向上を可能にする有用な研究ツールを提供してくれる。さらに、このようなモデルは、既存のリハビリプロトコルを改良し、新たな適応症を開発するために、両方の前臨床試験を実施するために有用である。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
二股はんだ端子付きベクトルワイヤラップポスト	ニューアーク	T68
ベクトル回路基板	ニューアーク	3662から2
ポモナのパッチコード	ニューアーク	P-36から0
5分エポキシ	VOベイカー（株）	4001
スペクトル360の電極ジェル	ミリケン医療	MR41217
ポータブル神経筋刺激装置	EMPI	300pv