신경근육학 전기적 자극에 의​​해 근육 트레이닝의 Murine 모델

요약

앞부분 구획 근육에 신경근육학 전기 자극을 murine 모델 (NMES), 안전하고 저렴한 임상 양상은 설명되어 있습니다. 이 모델은 마우스로 타겟 및 특정 근육의 수축을 도출하도록 의도하기위한 목적으로 즉시 사용할 임상 장치 수정의 장점이 있습니다.

초록

신경근육학 전기 자극 (NMES)는 널리 ² 유지하거나 ^3-5 근육의 기능적 능력을 향상, ^1을 복원하는 데 사용되는 일반적인 임상 양상이다. 골격근의 Transcutaneous 표면 자극이되므로 모터 유닛과 주위의 근육 섬유의 흥분을 유도하는 음극과 양극 사이의 전류 흐름을, 포함한다.

NMES는 여러 가지 이유로 골격근 적응 반응을 평가하는 매력적인 양상이다. 첫째, 같은 myofiber의 hypertophy 및 근육 강화 ^6, angiogenesis ^7-9, 성장 인자의 분비 ^9-11, 및 근육의 전구체 세포 활성화 ^12와 같은 생리적 adaptations은 잘 문서화되어있는 재현성 실험적인 모델을 제공합니다. 이러한 생리적 반응은 신중하게 자극을 서로 다른 매개 변수 (Cochrane 검토를 위해, ^{13 참조)를} 사용 titrated 수 있습니다. 또한, 신병을 NMES모터 단위가 아닌 선택적으로, 그리고 spatially 고정하고 temporally 동기 방식 ^14, 모든 섬유에 대한 치료 효과를 exerting의 이점을 제공 관계없이 섬유의 유형. 말초 정맥 질환 또는 강한 악의를 포함한 임상 인구에서 NMES로 지정된 contraindications가 있지만 예를 들어, NMES도 질병 및 / 또는 누워만있는 사람과 엄격한 운동 도전 수있는 인구를위한 안전하고 가능한 것입니다.

여기서는 상용 전극을 채택하고 murine 모델을 사용 NMES 프로토콜을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 동물 모델은 임상적으로 사용 가능한 장치를 이용하여 원하는 근육 수축성 효과를 유도하기위한 전극의 위치에 관한 즉각적인 피드백을 제공하는 장점이 있습니다. 본 원고의 목적을 위해서는 마우스 hindlimb의 앞부분 구획 근육의 근육 자극을 위해 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

1. 전극 준비

• 벡터 회로 기판의 1cm X 1cm 부분을 잘라내기.
• 간격은 약 3.5 mm를 잊어버리고 핀과 함께 바이스 그립를 사용하여 두 wirewrap 핀을 안정. 핀이 bifurcated 종료까지 직면해야한다.
• needlenose 플라이어를 사용하여, 대략 중간 그들의 길이를 따라, 90 ° 각도로 핀을 wirewrap 잡아봐.
• 와이어 절연가 벗겨진하여 커넥터, 리드 연결에서 약 7cm의 구리 전선을 쉽게받을 수 있습니다.
• 하나 wirewrap 핀의 bifurcated 끝에 솔더 구리 전선 중 하나. 다른 wirewrap 핀에 대한 납땜 단계를 반복합니다.
• 보온 및 안정화하기 위해 구리선과 금색 핀 사이에 납땜 연결에 튜브를 수축 당기세요. 납땜 팁을 사용하여 튜브를 가열.
• 브레드 보드에 회로 기판의 인접한 개구부로 wirewrap 핀이 unsoldered 도움말을 넣습니다.
• wirewrap 핀은 서로 평행하며 성임을 확인보드를 통해 배치하면 도움말이 동일한 거리에 위치하고있는 등 브레드 보드를 통해 ick.
• 투명 에폭시의 핀이 납땜 끝을 포함시킵니다. 에폭시는 약 10 분 동안 치료하도록 허용하거나, 완전히 건조까지.
• 핀 및 벡터 회로 기판이 완전히 리드 와이어에 대한 구조적 무결성 및 스트레인 릴리프를 제공하기 위해 임베디드 때까지 에폭시의 적용을 반복합니다.
• 골드 핀의 팁을 노출 금속 파일을 사용하여 에폭시 아래로 모래.
• 리드 와이어는 적절한 지속성을 가지고 두 개의 리드가 전기 누전되지 않도록하고 그것에 멀티미터를 사용하여
• 전극 여성 양방향 와이어 커넥터 (포모나 ​​패치 코드)로 NMES 장치에서 리드를 연결합니다.

2. 동물 준비

• 동물은 100 % O ₂ 기체에 2 % isofluorane (애보트 래버러토리스, 노스 시카고, IL)을 사용하여 흡입을 통해 anesthetized 있습니다. 동물 t에 걸쳐 anesthetized 유지됩니다그는 세션을 NMES.
• 시작하기 전에 NMES 프로토콜 동물 완전히 anesthetized한지 확인하는 것은 발가락 핀치를 수행합니다.
• 동물은 정기적으로 마취 수준이 충분한지 확인하기 위해서는 자극에 대한 응답을 확인한다. 필요에 따라 마취가 조정되어야합니다. 자극 다리, 호흡 깊이의 변화, 그리고 점액 점막의 색깔의 그것보다 다른 운동은 모두 마취의 깊이를 모니터하고 정기적으로 평가되어야한다.
• 측면 드러누움의 동물을 둡니다.
• 절차를 수행하는 동안 각막 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 윤활제를 적용합니다.
• 취급하는 hindlimb 영역을 면도하고, 알코올로 닦아냅니다.
• 물로 린스 후, 3 % 표백제와 전극을 닦아주십시오.
• 전극이 적용됩니다 사이트를 통해 젤을 수행 레이어를 적용합니다. 전극과 피부 사이의 전류 흐름을 보장하기 위해 NMES 프로토콜 전반에 걸쳐 필요한 경우 다시 적용합니다.
• 가열 램프 OR 순환 용수 이불 정상 코어 바디 범위를 유지하는 데 사용해야합니다.
• 참고 : 모든 절차 검토와 승인을 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회와 보장 PHS와 AAALAC INT로 진행되었습니다. 공인 프로그램과 시설을 갖추고 있습니다.

3. 자극

• 전극 배치 :
  • tibialis의 앞부분과 신근 digitorum의 longus 근육을 포함한 앞부분 구획 근육의 자극을 위해 직접 일반적인 peroneal 신경의 말초 가지 꺼져 동물의 깊은 fibular 신경, 동안 표면 전극을 배치하고들에게 단지 앞쪽에 위치하고 있습니다 fibular 머리.
  • 자극은 전체 발목 dorsiflexion와 숫자의 전체 연장 elicits 때 앞부분 구획 근육의 자극은 전극의 위치가 확인됩니다. 한편, dorsiflexion은 자리 확장자의 부재로 제시만이 tibialis 앤티rior 근육이 자극되고 있습니다. 이러한 타겟 수축성 반응은 연구 설계에 따라 바람직있을 수 있습니다.
  • 초기 동안 발생 자유롭게 움직이는, 동심 단계 ~ 0.5 초 : 근육 수축은 자극의 2 단계로 나뉘어져 있습니다. 이 첫 단계 동안, 앞발로 땅을 차다는 최대한 dorsiflexion와 숫자 확장 휴식 위치에서 이동합니다. 자극의 두 번째 단계는 최종 범위 dorsiflexion 및 자리 내선 번호 지속 사시 수축이다.
• 자극 매개 변수 :
  • 이 NMES 모델은 기존 NMES 2 채널 (표 참조) 제공 300 PV Empi 다기능 전기 요법 장치를 활용합니다. 이 모델의 목적을 위해서만 1 채널이 사용됩니다.
  • 사용되는 매개 변수는 대칭 파형 150 μs의 펄스 기간 및 50Hz의 주파수를 포함합니다. 자극 시간은 0.5 초 램프 위쪽 및 아래쪽 0.5 초 램프로, 5 초로 설정됩니다. 이것은 근육이 accli 더 점진적 수있게 해자극에 친구. 현재 프로토콜에서 수축 사이에 시간을 떨어져 10 초로 설정되었지만, 이것은 원하는 효과에 따라 조정될 수 있습니다. 배 밖 감소 근육 피로의 더 급속한 개시가 높아집니다. 이러한 자극 매개 변수는 상당한 골격근 손상 ^{1, 15, 16를} 유도하지 않고, 신경근육학 전기 자극을 사용하여 근육의 강도를 향상시키기위한 임상 프로토콜을 기반으로했다.
  • 마우스는 세트 사이에 5 분 휴식으로, 10의 수축이 두 세트를 완료합니다.
  • 성인 동물의 경우 NMES 강도는 일반적으로 9mA에서 시작됩니다. 우리의 경험에서 이것은 자극에 따라 즉시 눈에 보행 장애를 유발하지 않는 최대한의 농도로 시작하는 대략적인 것입니다. 이후 NMES 세션의 경우 강도가 1mA에 의해 동물 20 전체 dorsiflexions을 완료할 수 있습니다 때마다 증가합니다.
• 자극 프로토콜과 reco 완료 이후매우 마취에서 동물은 일반적으로 정상적인 걸음걸이와 자세를 보여줍니다. 걸음걸이는 NMES 프로그램의 기간에 걸쳐 손상되지 않은 유지됩니다.

4. 대표 결과

야생 유형 (B6/10), B6.SCID 및 MDX / SCID 마우스 :이 문서에서 설명 NMES 프로토콜 등 여러 가지 마우스 종자에서 구현되었습니다. 3-5개월에서 4 주 (20 세션)을 통해 수행 NMES 대표 결과는 오래된 MDX / SCID가 제공됩니다.

동물을 편안하게 마취 하의 경추 탈구에 의해 euthanized되었다. tibialis 앞쪽에 근육은 2 메틸 부탄 액체 질소에 미리 냉각하고, -80에 저장된 ° C로 수확 즉시 냉동되었다 시리얼 크로스 섹션 (10 μm의)을 취득하고 슬라이드에 탑재되었다. 통계 분석은 (SPSS, v19.0 소프트웨어) 표준 통계 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행되었다. 첫째, Levene의 시험 여부가 WA를 평가하는 데 사용되었다변동의 님의 평등. 독립 표본 T-테스트는 다음 NMES 및 제어 그룹 간의 차이를 조사하기 위해 수행되었다.

Hematoxylin과 Eosin (H & E) 얼룩은 NMES 프로토콜은 dystrophic 근육의 증가 부상을 초래 하리라는 사실 여부를 조사하기 위해 수행되었다. 섹션 중 하나가 선택되고, 사진은 빛을 현미경 (니콘 이클립스 E800, 니콘, 일본)를 사용하여 획득했다. 재생 인덱스에는 상당한 증가 (중앙 nucleated 섬유의 수가 없었습니다 개발 이미지 분석 소프트웨어, 이미지 제이 - 섬유 및 중앙에 위치한 핵 가진 섬유의 개수의 총수는 수동으로 국립 보건원 (NIH)을 사용하여 계산되었다 그림 1); / NMES에 제출된 동물 섬유의 총수)은 같은 컨트롤 (P = 0.802에 비해. 이것은 NMES의 응용 프로그램이 dystrophic 동물에서 관찰 변성 - 재생 계단식으로 증가하지 않는 것이 좋습니다, 따라서 가능성이 없습니다증가된 근육 부상을 일으킬 수 있습니다.

CD31에 대한 Immunofluorescent 염색법은 근육 vascularity에서 4 주간의 NMES 프로토콜의 효과를 조사하기 위해 수행되었다. 간단히, 근육 섹션은 포르말린 4%에서 해결 5 % 말 혈청 (HS)를 사용하여 차단되었습니다. 섹션은 쥐의 반 마우스 일차 항체 (5 % HS에서 1:300 희석)으로 incubated 및 555-라벨이 염소 안티 쥐 이차 항체 (5 % HS에서 1:300 희석)로 치료되었다. CD31 양성 세포의 총 개수를 정할 한 섹션이 선택하고, 형광 현미경을 (니콘 이클립스 E800, 일본)를 사용하여 사진에 찍혔다. 모세 혈관의 총수는 수동 북부 이클립스 소프트웨어 (Empix 이미징 주식 회사)를 사용하여 계산되었다. NMES 프로토콜과 같은 골격 근육 angiogenesis를 촉진 설명을 나타냅니다; 컨트롤 (그림 2 P <0.01)에 비해 NMES에 제출된 동물의 CD31 양성 세포의 수가 크게 증가가 발생했습니다.

현장 수축성 테스트의 경우 : 4 주 NMES 프로토콜의 완료 후, 앞부분 구획 근육의 수축성 테스트는 현장 테스트 장치 (모델 809B, 오로라 과학 INC, 캐나다), 자극기 (모델 701C, 오로라 과학 INC에서를 사용하여 수행되었다 캐나다), 그리고 힘 변환기 (오로라 과학 INC, 캐나다). 간단히, anesthetized 동물의 peroneal 신경은 무릎의 측면에 작은 절개를 통해 격리되었다. 마우스는 다음 플랫폼에서 부정사 배치되었으며 테스트되고 발이 footplate에 위치했다. 테스트에 사용된 hindlimb는 무릎 및 발을 헝겊 테이프로 안정되었다. 근육이 피부 아래에 삽입 훅 전극을 사용하여 자극했다. 근육 파상풍의 수축은 4 주 NMES 프로토콜은 근육의 힘을 향상을 일으킬 것인지 여부 조사를 위해 350ms에 대해 150Hz의 주파수에서 테스트되었습니다. 결과는 서부 유럽 표준시 근육 무게로 정상화되었다. tetan의 약 30 % 증가가 발생했습니다설명된 프로토콜을 제안 컨트롤 (P = 0.005) (그림 3)에 비해 NMES에 제출된 동물의 IC의 수축은 MDX / SCID 동물의 골격 근육의 강도를 향상시킵니다.

NMES 4 주 후) 치료 컨트롤, B). 그림 dystrophic 1 Hematoxylin & Eosin 골격근의 염색법 (MDX) / immunodeficient 생쥐 (4-5개월) (10 배 확대).

그림 2. dystrophic의 골격근 (MDX) / immunodeficient 생쥐 (4~5개월) (20x 배율)) 치료 컨트롤에서 골격근의 vascularity의 마커와 같은 CD31 immunofluorescence (빨강), B) 4 주 후 NMES.

그림 3. 수축성 테스트앞부분 구획 컨트롤의 근육 및 4 주간 NMES로 치료 동물. mNm = 밀리 뉴턴 미터. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

토론

이러한 결과는 NMES 우리의 개발 murine 모델은 골격근의 angiogenesis (그림 2)와 강화 (그림 3)을 촉진하지만, 골격근의 손상 (그림 1)을 유발하지 않는 것이 좋습니다.

그것은 여기에서 설명한 자극 매개 변수 앞부분 구획 근육에 과부하 근육을 유도하도록 설계되었습니다 것을인지해야합니다. 임상 시나리오의 경우는 것처럼, 전극 배치는 NMES으로 근육의 반응은 섬유 형태 구성에 따라 다를 수 있지만, 다른 근육 그룹을 자극하기 위해 조정할 수 있습니다. NMES 기간, 치료 세션의 총 개수, 그리고 반복의 총수는 디자인을 공부하고 따라 변경될 수 있습니다.

모든 프로토콜과 마찬가지로이 방법은 주목되어야 제한 사항이 있습니다. 현재의 연구에서는 자극이 깊은 fibular 신경을 통해 수행되었다. 그러나, 병원에서 자극 전S는 일반적으로 모터 단위에서 실시. 동물 모델에서 신경의 자극은 완전한 근육 수축을 유도하기 위해 낮은 강도를 요구한다. 제시와 같은 모델의 또 다른 한계는 우리가 동물 anesthetized는 것을 주어, NMES의 응용 중에 정보에 관한 안락 수준을 얻을 수없는 것입니다. 따라서 임상 인구의 비교 농도의 tolerability는 평가하기 어렵다. 그러나 저희 histological 결과 설명한 바와 같이, 근육 부상을 유발하지 않는, 우리의 NMES 모델을 제안한다.

일반적으로 병원에서 구현 modalities가 치료 개입에 대한 세포 및 분자 응답의 향상된 이해를 허용 유용한 실험 도구를 제공해 모방 동물 모델의 개발. 또한, 이러한 모델은 기존의 재활 프로토콜을 수정하고 새로운 징후를 개발하기위한 사전 임상 연구를 수행하는 데 유용합니다.

자료

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bifurcated 납땜 단자와 벡터 와이어 랩 게시물	뉴어크	T68
벡터 회로 기판	뉴어크	3662-2
포모나 패치 코드	뉴어크	P-36-0
오분 에폭시	조종 베이커 (주)	4001
스펙트럼 360 전극 젤	밀리켄 의료	MR41217
휴대용 신경근육학 자극 장치	EMPI	300pv