Un modèle murin de la formation du muscle par stimulation neuromusculaire électrique

Résumé

Un modèle murin de la stimulation électrique neuromusculaire (NMES), une modalité sûre et peu coûteuse clinique, aux muscles compartiment antérieur est décrit. Ce modèle a l'avantage de la modification d'un dispositif de facilement disponibles clinique dans le but de provoquer des contractions musculaires ciblées et spécifiques chez la souris.

Résumé

La stimulation électrique neuromusculaire (NMES) est une modalité clinique commun qui est largement utilisé pour restaurer ^{1, 2} ou maintenir améliorer la capacité fonctionnelle du muscle ^3-5. Stimulation de surface transcutanée du muscle squelettique comprend une circulation de courant entre une cathode et une anode, en induisant ainsi l'excitation de l'unité motrice et les fibres musculaires entourant.

NMES est une modalité intéressante pour évaluer les réponses adaptatives des muscles squelettiques, pour plusieurs raisons. Premièrement, elle fournit un modèle reproductible expérimentale dans laquelle des adaptations physiologiques, tels que hypertrophie myofibrille et ⁶ de renforcement musculaire, l'angiogenèse ^7-9, la sécrétion du facteur de croissance ^9-11, et l'activation des cellules musculaires précurseurs ¹² sont bien documentés. Ces réactions physiologiques peuvent être soigneusement titré en utilisant différents paramètres de stimulation (pour une revue Cochrane, voir ^13). En outre, NMES recruesunités motrices non sélectivement, et d'une manière fixe dans l'espace et dans le temps synchrone ^14, offrant l'avantage d'exercer un effet de traitement sur ​​tous les fibres, indépendamment du type de fibres. Bien qu'il existe des contre-indications spécifiées à NMES dans les populations cliniques, y compris les troubles veineux périphériques ou maligne, par exemple, NMES est sûr et faisable, même pour ceux qui sont malades et / ou grabataires et pour les populations dans lesquelles l'exercice rigoureux peuvent être difficiles.

Ici, nous démontrons le protocole d'adaptation électrodes disponibles dans le commerce et l'exécution d'un protocole NMES utilisant un modèle murin. Ce modèle animal a l'avantage d'utiliser un dispositif disponible en clinique et en fournissant une rétroaction instantanée sur le positionnement de l'électrode de susciter l'effet désiré musculaire contractile. Aux fins de ce manuscrit, nous allons décrire le protocole de stimulation musculaire des muscles compartiment antérieur d'un membre postérieur de la souris.

Protocole

1. Préparation des électrodes

• Coupez un 1 cm x 1 cm de section du circuit vecteur.
• Stabiliser 2 broches WIREWRAP l'aide d'un étau, avec des épingles espacées d'environ 3,5 mm d'intervalle. Les extrémités bifurquées des broches doivent être vers le haut.
• Pliez connexion enroulée broches à un angle de 90 °, environ à mi-chemin le long de leur longueur, en utilisant une pince à bec effilé.
• Exposer les fils de cuivre de connecteurs, d'environ 7 cm de connexion de plomb, en dépouillant l'isolant des fils.
• Brasure un des fils de cuivre à l'extrémité bifurquée d'une des repères WIREWRAP. Répétez l'étape de soudage pour la broche WIREWRAP autre.
• Tirez un tube rétractable à connexion soudée entre les fils de cuivre et épingles d'or, afin d'isoler et de stabiliser. Chauffer le tube à l'aide de la pointe à souder.
• Insérez les conseils dessoudé des broches dans les ouvertures WIREWRAP adjacentes de la carte de circuit imprimé carte de test.
• Faire en sorte que les repères de connexion enroulée sont parallèles les uns aux autres et rick travers la carte de test tels que les conseils sont situés à la même distance lorsqu'il est placé à travers le conseil d'administration.
• Intégrer extrémités soudées des broches en époxy clair. Laisser sécher la colle pendant environ 10 minutes, ou jusqu'à ce que complètement sec.
• Répéter l'application de résine époxy jusqu'à ce que les repères et dans le circuit vecteur sont entièrement noyés dans afin de fournir l'intégrité structurale et la décharge de traction pour les câbles.
• Poncer l'époxy en utilisant un fichier de métal pour exposer les extrémités des repères d'or.
• Utiliser un multimètre pour s'assurer que les deux fils ne sont pas court-circuit électrique et que les fils de plomb ont une bonne continuité
• Fixez l'électrode conduit de l'appareil au connecteur NMES fil femelle 2 voies (cordon de raccordement Pomona).

2. Préparation des animaux

• Les animaux sont anesthésiés par inhalation à l'aide isofluorane 2% (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) dans 100% d'O ₂ du gaz. L'animal doit rester anesthésié tout au long til NMES session.
• Avant de commencer le protocole NMES effectuer une pincement de l'orteil afin de s'assurer que l'animal est entièrement anesthésié.
• Animaux doivent être inspectés régulièrement pour la réponse à la stimulation en vue d'assurer le niveau d'anesthésie est suffisante. L'anesthésie doit être ajustée au besoin. Mouvement autre que celui de la jambe stimulée, des changements de profondeur respiratoire, et la couleur de tous les muqueuses doit être évaluée régulièrement pour surveiller la profondeur de l'anesthésie.
• Placez l'animal en décubitus latéral.
• Appliquer du lubrifiant ophtalmique pour les yeux afin d'éviter le séchage de cornée au cours de la procédure.
• Rasez la zone des membres postérieurs à traiter, et essuyez avec de l'alcool.
• Essuyez l'électrode avec l'eau de Javel à 3%, puis rincer avec de l'eau.
• Appliquer une couche de gel conducteur sur le site où l'électrode sera appliquée. Réappliquer au besoin pendant le protocole ESNM pour assurer un écoulement de courant entre l'électrode et la peau.
• Une chaleur lampe ocouverture r l'eau circulant doit être utilisé pour maintenir un taux normal varie de corps de base.
• Remarque: Toutes les procédures ont été examinées et approuvées par le soin des animaux Université de Pittsburgh et institutionnel Comité utilisation et réalisée par PHS assuré et AAALAC Int. programme accrédité et installations.

3. Stimulation

• Le placement des électrodes:
  • Pour la stimulation des muscles des compartiments antérieurs, y compris le muscle tibial antérieur et le muscle long extenseur des orteils, placez l'électrode de surface directement au-dessus profonde de l'animal nerf fibulaire, qui est une branche distale hors du nerf fibulaire commun, et il est situé juste en avant du l' tête du péroné.
  • Pour la stimulation des muscles compartiment antérieur, le placement de l'électrode est confirmée lorsque la stimulation provoque dorsiflexion de la cheville complète et une extension complète des chiffres. D'autre part, la dorsiflexion, en l'absence de chiffres du poste suggère que seul le jambier anterieure du muscle est stimulé. Une telle réponse ciblée contractile peut être souhaitable, en fonction de conception de l'étude.
  • La contraction musculaire est divisé en 2 phases de stimulation: une zone de libre mouvement, la phase concentrique, qui survient pendant la période initiale ~ 0,5 secondes. Au cours de cette première phase, la patte se déplace d'une position de repos à la flexion dorsale maximale et chiffres du poste. La deuxième phase de stimulation est une contraction isométrique soutenue à la fin de gamme dorsiflexion et l'extension chiffres.
• Les paramètres de stimulation:
  • Ce modèle utilise la NMES 300 PV Empi appareil d'électrothérapie multifonction, qui fournit 2 canaux de NMES conventionnels (voir le tableau). Pour les fins de ce modèle, seulement 1 canal est utilisé.
  • Paramètres de forme d'onde utilisés comprennent symétrique, une durée d'impulsion de 150 ms et une fréquence de 50Hz. Le temps de stimulation est réglé à 5 secondes, avec une hausse de 0,5 seconde rampe et une rampe de 0,5 secondes vers le bas. Cela permettra au muscle de façon plus graduelle acclicompagnon à la stimulation. Dans le protocole actuel, hors du temps entre les contractions a été fixé à 10 secondes, mais cela peut être ajustée en fonction de l'effet désiré. Diminution hors temps se traduira par une initiation plus rapide de la fatigue musculaire. Ces paramètres de stimulation ont été basés sur des protocoles cliniques visant à améliorer la force musculaire en utilisant la stimulation électrique neuromusculaire, sans induire d'importants dommages du muscle squelettique ^{1, 15, 16.}
  • Souris remplir deux séries de 10 contractions, avec 5 minutes de repos entre les séries.
  • Pour les animaux adultes, l'intensité est généralement initiée NMES à 9 mA. D'après notre expérience, cela est approximatif à l'intensité maximale de départ qui n'induit pas une anomalie de la démarche et immédiatement perceptible après la stimulation. Pour les sessions ultérieures NMES, l'intensité est augmentée de 1 mA à chaque fois que les animaux sont capables de compléter 20 dorsiflexions à part entière.
• Après l'achèvement de la stimulation et le protocole recotrès de l'anesthésie, les animaux en général preuve d'une démarche normale et de la posture. Gait doit rester intact pendant toute la durée du programme NMES.

4. Les résultats représentatifs

Le protocole NMES décrit dans cet article a été mis en œuvre dans plusieurs souches de souris, y compris: de type sauvage (B6/10), B6.SCID et mdx / souris SCID. Les résultats représentatifs de NMES effectuées pendant 4 semaines (20 séances) en 3-5 mois mdx / SCID sont présentés.

Les animaux ont été euthanasiés sans cruauté par dislocation cervicale sous anesthésie. Le muscle tibial antérieur a été récolté et immédiatement congelés dans de 2-méthyl-butane pré-refroidi dans l'azote liquide, et conservés à -80 ° C. Serial sections (10 um) ont été obtenus et monté sur des lames. Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant des logiciels statistiques (SPSS, v19.0 logiciel). Tout d'abord, le test de Levene a été utilisé pour déterminer s'il ya wal'égalité des variances s. Échantillons indépendants t-test a ensuite été réalisée pour étudier les différences entre NMES et les groupes témoins.

Hématoxyline et l'éosine (H & E) des taches ont été effectuées pour vérifier si le protocole NMES causerait un dommage a augmenté dans le muscle dystrophique. Une section a été sélectionné, et les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope optique (Nikon Eclipse E800; Nikon, Japon). Le nombre total de fibres et le nombre de fibres à noyaux central ont été comptées manuellement à l'aide de la National Institutes of Health (NIH) - a développé un logiciel d'analyse d'image, Image J. Il y avait pas d'augmentation significative de l'indice de régénération (nombre de fibres central nucléées / nombre total de fibres) dans les animaux soumis à NMES, par rapport aux témoins (p = 0,802; Figure 1). Ceci suggère que l'application de la NMES n'augmente pas la cascade la dégénérescence-régénération observée chez les animaux dystrophiques, et est donc peu probableà induire une lésion musculaire.

La coloration par immunofluorescence pour CD31 a été réalisée pour étudier l'effet du protocole de 4 semaines sur la vascularisation du muscle NMES. En bref, les sections musculaires ont été fixés dans du formol 4% et bloqué au moyen de 5% de sérum de cheval (HS). Les articles ont été incubées avec un rat anti-souris anticorps primaire (1:300 dilution dans 5% HS) et traitée avec une chèvre anti-rat d'anticorps 555-secondaire marqué (1:300 dilution dans 5% HS). Afin de quantifier le nombre total de cellules positives CD31, une section a été choisi, et photographié en utilisant la microscopie fluorescente (Nikon Eclipse E800, le Japon). Le nombre total des capillaires a été comptées manuellement à l'aide du Nord Eclipse Software (Empix Imaging Inc). Il y avait une augmentation significative du nombre de cellules positives CD31 chez les animaux soumis à NMES par rapport aux témoins (p <0,01; figure 2), ce qui indique que le protocole NMES comme décrit favorise l'angiogenèse muscle squelettique.

Dans les essais in situ contractile: Quatre semaines après la fin d'un protocole NMES, les tests de contraction des muscles compartiment antérieur a été effectuée en utilisant un appareil de tests in situ (Modèle 809B, Aurora Scientific Inc, Canada), stimulateur (modèle 701C, Aurora Scientific Inc , Canada), et capteur de force (Aurora Scientific Inc, Canada). En bref, le nerf sciatique poplité externe des animaux anesthésiés a été isolé par une petite incision latérale du genou. Les souris ont été ensuite placé en décubitus dorsal sur une plate-forme et le pied mis à l'essai a été placé sur la platine. Le membre postérieur utilisé pour le test a été stabilisée avec un ruban de toile sur le genou et le pied. Les muscles ont été stimulés à l'aide d'un crochet électrodes insérées sous la peau. Muscle tétanique contraction a été testé à une fréquence de 150Hz pour 350ms afin de déterminer si le protocole de 4 semaines NMES induirait des améliorations dans la force musculaire. Les résultats ont été normalisé à la masse musculaire humide. Il y avait une augmentation d'environ 30% dans le tetancontraction ic des animaux soumis à NMES, par rapport aux témoins (p = 0,005) (figure 3), ce qui suggère le protocole décrit améliore la force musculaire squelettique mdx / SCID animaux.

. Figure 1 coloration hématoxyline éosine et le muscle squelettique des dystrophique (MDX) / des souris immunodéficientes (4-5 mois) (grossissement 10x): A) les contrôles non traités, B) après 4 semaines de NMES.

Figure 2. CD31 immunofluorescence (rouge), en tant que marqueur de la vascularisation du muscle squelettique, dans le muscle squelettique des dystrophique (MDX) / des souris immunodéficientes (4-5 mois) (grossissement de 20x) A) les contrôles non traités, B) après 4 semaines de NMES.

Figure 3. Essais contractiledes muscles compartiment antérieur en matière de contrôle et les animaux traités avec NMES pour 4 semaines. mNm = milli Newton-mètres. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

Ces résultats suggèrent que notre modèle murin de NMES développé favorise l'angiogenèse muscle squelettique (figure 2) et le renforcement (Figure 3), mais n'induit pas d'altération du muscle squelettique (Figure 1).

Il convient de noter que les paramètres de stimulation décrites ici ont été conçus pour induire une surcharge musculaire aux muscles compartiment antérieur. Tout comme c'est le cas pour les scénarios cliniques, le placement des électrodes peut être ajustée pour stimuler d'autres groupes musculaires, bien que la réponse musculaire à NMES peut être différent, en fonction de la composition type de fibre. NMES durée, le nombre total de séances de traitement, et le nombre total de répétitions peut être modifié en fonction des études de design.

Comme avec n'importe quel protocole, cette méthode a des limites qui doivent être notés. Dans la présente étude, la stimulation a été réalisée sur le nerf fibulaire profond. Cependant, dans la clinique, la stimulation is généralement administré à l'unité moteur. Dans le modèle animal, la stimulation du nerf, il faudrait une intensité plus faible afin d'obtenir la contraction musculaire complète. Une autre limitation du modèle tel que présenté, c'est que nous sommes incapables d'obtenir le niveau de confort des informations concernant lors de l'application de la NMES, étant donné que les animaux sont anesthésiés. Par conséquent, la tolérance des intensités comparables dans une population clinique est difficile à évaluer. Cependant, nos résultats suggèrent histologiques notre modèle NMES, tel que décrit, ne pas provoquer de blessures musculaires.

Le développement de modèles animaux qui miment les modalités couramment mises en œuvre dans la clinique nous fournir des outils de laboratoire utiles qui permettent à une meilleure compréhension des réponses cellulaires et moléculaires à des interventions thérapeutiques. En outre, ces modèles sont utiles pour effectuer des études précliniques à la fois d'affiner les protocoles de réhabilitation existants et de développer de nouvelles indications.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Vecteur messages wrapping avec borne à souder bifurquée	Newark	T68
Vecteur de circuit	Newark	3662-2
Cordon de raccordement Pomona	Newark	P-36-0
5 époxy minute	VO Baker Co.	4001
Gel Spectra électrode 360	Milliken médicale	MR41217
Portable dispositif de stimulation neuromusculaire	EMPI	300PV