Мышиной модели Мышцы обучение по нервно-мышечной электростимуляции

Резюме

Мышиной модели нервно-мышечной электростимуляции (NMES), безопасный и недорогой клинической модальности, в передней мышцы отсек описано. Эта модель имеет то преимущество, изменить доступными клиническими устройств с целью выявления целевых и специальных сокращений мышц у мышей.

Аннотация

Нервно-мышечной электростимуляции (NMES) является широко распространенным клиническим методом, который широко используется для восстановления ^{1, 2} или поддерживать повышение ^3-5 мышц функциональных возможностей. Чрескожная стимуляция поверхности скелетных мышц включает в себя ток между катодом и анодом, тем самым вызывая волнение двигателя и окружающих мышечных волокон.

NMES является привлекательным методом для оценки скелетных мышцах адаптивные реакции по нескольким причинам. Во-первых, он обеспечивает воспроизводимые экспериментальные модели, в которой физиологических адаптаций, таких как гипертрофия myofiber и укрепления мышц ^{6, 7-9} ангиогенеза, фактор роста секреции ^9-11, и мышцы предшественник активации клеток ^12, хорошо документированы. Такие физиологические реакции могут быть тщательно титруют, используя различные параметры стимуляции (для Кокрановского обзора, см. ^13). Кроме того, НМС новобранцевмоторных единиц, не выборочно, а в пространственно-временном фиксированной и синхронно ^14, предлагая преимущества оказывать лечебный эффект на всех слоев, независимо от типа волокна. Несмотря на указанные противопоказания к NMES в клинической населения, в том числе нарушения периферического венозного или злокачественности, например, NMES является безопасным и возможно, даже для тех, кто болен и / или прикованы к постели и для населения, в котором строгие физические упражнения могут оказаться непростой задачей.

Здесь мы показываем, протокол адаптации продаже электродов и выполнения протокола NMES использованием мышиной модели. Это животное модель имеет то преимущество, используя клинически доступных устройств и обеспечивая постоянную обратную связь относительно расположения электродов, чтобы вызвать нужную мышцу сократительную силу. Для этой рукописи мы опишем протокол для мышц стимуляции мышц передней отсеке мышь задних конечностей.

протокол

1. Подготовка электродов

• Вырезать 1 см х 1 см раздел плате вектор.
• Стабилизация 2 wirewrap контакты помощью вице-захват, с булавками на расстоянии приблизительно 3,5 мм друг от друга. Раздвоенные концы штифтов должен быть обращен вверх.
• Согните wirewrap контакты на угол 90 °, примерно на полпути вдоль их длины, используя острогубцы.
• Вынести медные провода разъемов, около 7 см от ведущего связи, путем удаления изоляции.
• Припой одно из медных проволок с раздвоенным концом одного контакта wirewrap. Повторите шаг пайки для других контактных wirewrap.
• Потяните сокращаться трубы на пайке связь между медными проводами и золотые контакты для того, чтобы изолировать и стабилизировать. Нагрейте трубы помощью жала паяльника.
• Вставьте распаяны кончики wirewrap контакты в соседних отверстий платы макета.
• Убедитесь, что wirewrap контакты расположены параллельно друг другу и йИк через макет так, что Советы находятся на таком же расстоянии при размещении через борт.
• Вставить паяных концы штифтов в открытом эпоксидной смолы. Позвольте эпоксидной вылечить в течение примерно 10 минут, или до полного высыхания.
• Повторите применение эпоксидных до булавки и совет вектор схема полностью встроены в целях обеспечения структурной целостности и защиты от натяжения для подводящих проводов.
• Песок вниз эпоксидной помощью металлического файле для предоставления советов в золотые булавки.
• Используйте мультиметр для обеспечения двух проводов не электрически короткого и подводящие провода имеют надлежащую преемственность
• Установите электрод ведет от устройства NMES к женскому 2-х проводов разъем (Помона патч-корд).

2. Подготовка животных

• Животные под наркозом с помощью ингаляции с использованием 2% isofluorane (Abbott Laboratories, Северный Чикаго, штат Иллинойс) в 100% O ₂ газ. Животное должно оставаться под наркозом всем тОн NMES сессии.
• Перед началом выполнения протокола NMES палец щепотку чтобы убедиться, что животное полностью под наркозом.
• Животные должны регулярно проверяться на ответ на стимуляцию, чтобы обеспечить уровень анестезии достаточно. Анестезия должна быть скорректирована по мере необходимости. Движение кроме этого вынужденного ноги, изменения в глубине дыхания, и цвет слизистых оболочек все должны оцениваться регулярно контролировать глубину анестезии.
• Поместите животных в боковом лежачее положение.
• Применение глазной смазкой для глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время процедуры.
• Бритье задних конечностей обрабатываемой поверхности и протереть спиртом.
• Протрите электрод с 3% хлорной извести, затем промыть водой.
• Нанесите слой геля на ведение сайта, где электродом будет применяться. Повторно по мере необходимости по всему протокол NMES обеспечить ток между электродами и кожей.
• Тепла лампы оГ циркулирующей воды одеяло должны быть использованы для поддержания нормального диапазона ядра тела.
• Примечание: все процедуры были рассмотрены и одобрены в Университете Питтсбурга Уходу за животными и использованию комитетом и осуществляется в PHS и заверил AAALAC Int. аккредитованной программе и сооружений.

3. Стимулирование

• Электрод размещения:
  • Для стимуляции передней мышцы отсек, в том числе передней большеберцовой и длинного разгибателя пальцев мышцы, поместите поверхности электрода непосредственно над глубоким малоберцовой кости животного нерв, который является дистальной ветви от общего малоберцового нерва, и расположен впереди головки малоберцовой кости.
  • Для стимуляции мышц передней отсеке, размещение электродов подтверждается, когда стимуляция вызывает полное сгибание лодыжки и полное расширение цифр. С другой стороны, сгибание, в отсутствие цифр расширение предполагает, что только большеберцовой антеРИОР мышцы стимулируются. Такие целевые сократительной реакции может быть желательно, в зависимости от дизайна исследования.
  • Сокращение мышц делится на 2 этапа стимуляции: бесплатный переезд, концентрической фазе, которая происходит во время первоначальной ~ 0,5 секунды. Во время этого первого этапа, лапы переходит от покоя к максимальной сгибание и номер. На втором этапе стимуляции изометрическое сокращение устойчивый в конце диапазона сгибание и номер.
• Стимуляция параметры:
  • Эта модель использует NMES 300 PV ЭМПИ многофункциональное устройство электротерапии, который обеспечивает 2 канала обычных NMES (см. таблицу). Для целей этой модели, только 1 канал.
  • Параметры, используемые включают симметричный сигнал, длительность импульса 150 мкс и частотой 50 Гц. Стимуляция время устанавливается до 5 секунд, 0,5 секунды до рампы и 0,5 секунды разгона вниз. Это позволит более мышцы постепенно accliмат на стимуляцию. В текущем протоколе, от времени между схватками был установлен на 10 секунд, но это может быть скорректирована в зависимости от желаемого эффекта. Снижение от раза приведет к более быстрому началу мышечной усталости. Эти параметры стимуляции были основаны на клинических протоколов, направленных на повышение мышечной силы использованием нервно-мышечной электростимуляции, не вызывая значительного повреждения скелетных мышц ^{1, 15, 16.}
  • Мыши выполнить два подхода по 10 сокращений, с 5-минутным отдыхом между множествами.
  • Для взрослых животных, NMES интенсивность, как правило, начатый в 9 мА. Исходя из нашего опыта, это приближается к максимальной интенсивности, что, начиная не вызывает заметного нарушения походки сразу после стимуляции. Для последующих сессиях NMES, интенсивность увеличивается на 1 мА каждый раз, когда животные в состоянии закончить 20 полных dorsiflexions.
• После завершения стимуляции протокола и выздоровееточень от наркоза, животные обычно демонстрируют нормальной походки и осанки. Походка должна оставаться нетронутыми в течение всей программы NMES.

4. Представитель Результаты

Протокол NMES описанные в этой статье был реализован в несколько линий мышей, в том числе: дикого типа (B6/10), B6.SCID и MDX / SCID мышей. Представитель результаты NMES осуществляется в течение 4 недель (20 занятий) в 3-5 месяца MDX / SCID представлены.

Животные были гуманно усыпляют шейным дислокации в то время как под наркозом. Передней большеберцовой мышцы собирают и сразу заморожена в 2 метил-бутан предварительно охлажденный в жидком азоте и хранили при температуре -80 ° C. Последовательный сечения (10 мкм) были получены и установлены на слайдах. Статистический анализ проводили с использованием стандартных статистических пакетов (SPSS, v19.0 программного обеспечения). Во-первых, тест Левин был использован, чтобы оценить, есть ли вас равенстве дисперсий. Независимые образцов Т-тест Затем был проведен для исследования различий между NMES и контрольной группах.

Гематоксилином и эозином (H & E) пятна были проведены исследовать вопрос о том протокол NMES приведет к увеличению травматизма в дистрофические мышцы. Один из разделов был выбран, и фотографии были получены с помощью светового микроскопа (Nikon Eclipse E800, Nikon, Япония). Общее количество волокон и количество волокон в центре города ядер вручную рассчитывали с использованием Национальных Институтов Здоровья (NIH) - разработал программное обеспечение для анализа изображений, Image J. Был никакого существенного увеличения регенерации индекс (число централизованно ядерные волокна / общее количество волокон) у животных представлены NMES, по сравнению с контрольной группой (р = 0,802; рис. 1). Это говорит о том, что применение NMES не увеличивает вырождение регенерации каскад наблюдается в дистрофические животных, и поэтому вряд либудет вызывать повышенный травмы мышц.

Иммунофлуоресцентного окрашивания на CD31 проводилось изучение влияния 4-неделе протокол NMES на мышцы кровоснабжение. Короче говоря, мышцы разделы были зафиксированы в 4%-ного формалина и блокировали при помощи 5% лошадиной сыворотки (HS). Срезы инкубировали с анти-крыса мышь первичных антител (1:300 разведения в 5% ГС) и обрабатывали 555-меченые козы против крыс вторичных антител (1:300 разведения в 5% ГС). Для количественной оценки общего числа CD31 позитивных клеток, одна секция была выбрана, и сфотографировали с помощью флуоресцентного микроскопа (Nikon Eclipse E800, Япония). Общее количество капилляров вручную рассчитывали с использованием Северного Затмение программного обеспечения (Empix изображений Inc.) Существовал значительное увеличение числа CD31 позитивных клеток у животных представлены NMES по сравнению с контрольной группой (р <0,01; рис. 2), что свидетельствует о NMES протокола, как это описано способствует скелетных мышц кровеносных сосудов.

В месте сократительной тестирования: четыре недели после завершения NMES протокол, сократительная тестирование передней мышцы отсек осуществляется с помощью аппарата на месте тестирования (модель 809B, Аврора научно Inc, Канада), стимулятор (модели 701C, Аврора научно Inc , Канада), и датчик силы (Aurora научно Inc, Канада). Короче говоря, малоберцового нерва под наркозом животным была выделена через маленький разрез сбоку от колена. Мышей помещали лежа на платформе и ног проходит испытания был установлен на подножку. Задние конечности, используемые для тестирования была стабилизирована тканью ленты на колена и стопы. Мышцы были стимулированы помощью крюка электродами вставляется под кожу. Сокращение мышц тетаническое была протестирована на частоте 150 Гц для 350 мс для расследования того, 4-недельного NMES протокол будет стимулировать улучшение мышечной силы. Результаты были нормированы на сырой массы мышц. Был примерно 30% увеличение tetanIC сокращение животных представлены NMES, по сравнению с контрольной группой (р = 0,005) (рис. 3), предполагая, что протокол, описанный улучшает скелетной мышечной силы в MDX / SCID животных.

На рис. 1 гематоксилин-эозином скелетных мышц окрашивания дистрофических (MDX) / иммунодефицитных мышей (4-5 месяцев), (10х)) необработанных контрольных, B) после 4 недель NMES.

Рисунок 2. CD31 иммунофлюоресценции (красный), в качестве маркера кровоснабжение скелетных мышц, в скелетных мышцах дистрофических (MDX) / иммунодефицитных мышей (4-5 месяцев) (20x увеличение)) необработанных контрольных, В) в течение 4 недель NMES.

Рисунок 3. Сократительная тестированияна передней мышцы отсек управления и животных, получавших NMES течение 4 недель. мНм = милли Ньютон метров. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Обсуждение

Эти результаты позволяют предположить, что наша развитая мышиной модели NMES способствует скелетных мышц кровеносных сосудов (рис. 2) и укрепления (рис. 3), но не вызывает повреждения скелетных мышц (рис. 1).

Следует отметить, что стимуляция параметры, описанные здесь, были разработаны, чтобы вызвать перегрузку мышц на передней мышцы отсека. Так же, как и в случае клинических сценариев, размещение электродов может быть скорректирована, чтобы стимулировать другие группы мышц, хотя мышцы ответ на NMES могут быть разными, в зависимости от состава волокон типа. NMES сроки, общее количество сеансов, а общее количество повторений может быть изменен в зависимости от дизайна исследования.

Как и любому протоколу, этот метод имеет ограничения, которые следует отметить. В настоящем исследовании, стимуляция была выполнена за глубокою малоберцового нерва. Тем не менее, в клинике, я стимуляциис обычно вводят в блок двигателя. В животной модели, стимуляция нервных потребует более низкой интенсивности в целях получения полного сокращения мышц. Еще одним недостатком модели, представленные в том, что мы не можем получить информацию относительно уровня комфорта при применении NMES, учитывая, что животные под наркозом. Таким образом, переносимость сопоставима интенсивности в клиническом населения трудно оценить. Тем не менее, наши результаты гистологического предлагаем нашим NMES модель, как описано, не вызывает повреждения мышц.

Развитие животных моделях, имитирующих условия обычно реализуется в клинике дают нам полезные инструменты лаборатории, что позволяет более глубокое понимание клеточных и молекулярных ответов лечебных мероприятий. Кроме того, такие модели являются полезными для проведения доклинических исследований и усовершенствовать существующие протоколы реабилитации и разработке новых показаний.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу
Векторные монтажа накруткой сообщения с раздвоенным терминала припоя	Ньюарк	T68
Векторные плате	Ньюарк	3662-2
Помона патч-кордов	Ньюарк	P-36-0
5 минут эпоксидной	В.О. Бейкер Ко	4001
Спектр 360 электрод Гель	Milliken медицинской	MR41217
Портативное устройство нервно-мышечной стимуляции	ЭМПИ	300pv