Einem Mausmodell der Muscle Training durch neuromuskuläre Elektrostimulation

Zusammenfassung

Ein Mausmodell einer neuromuskulären Elektrostimulation (NME) eine sichere und kostengünstige klinische Modalität, um den vorderen Abteil Muskeln beschrieben. Dieses Modell hat den Vorteil, Modifizieren eines leicht verfügbaren klinischen Einrichtung zum Zweck hervorzurufen gezielten und spezifischen Muskelkontraktionen in Mäusen.

Zusammenfassung

Neuromuskuläre elektrische Stimulation (NMES) ist eine häufige klinische Modalität, die häufig verwendet wird wieder Anspruch ^{1, 2} oder aufrechtzuerhalten erweitern ^3-5 Muskel Leistungsfähigkeit. Transkutane Oberflächenstimulation der Skelettmuskulatur beinhaltet einen Stromfluss zwischen einer Kathode und einer Anode, wodurch die Spannung der Induktion der Motoreinheit und den umliegenden Muskelfasern.

NMES ist eine attraktive Behandlungsmöglichkeit, um Skelettmuskel adaptive Reaktionen aus mehreren Gründen zu bewerten. Erstens bietet es einen reproduzierbaren experimentellen Modell, in dem physiologischen Anpassungen wie myofiber hypertophy und Muskelkräftigung ^{6, 7-9} Angiogenese, Wachstumsfaktoren Sekretion ^9-11, und Muskel-Vorläufer-Zell-Aktivierung ¹² gut dokumentiert sind. Solche physiologischen Reaktionen können sorgfältig titriert werden unter Verwendung verschiedener Parameter der Stimulation (für Cochrane-Review, siehe ^13). Darüber hinaus NMES Rekrutenmotorischen Einheiten nicht selektiv, und in einer räumlich und zeitlich fixiert synchron ^14, mit dem Vorteil der Ausüben einer Wirkung der Behandlung auf allen Fasern, unabhängig von Fasertyp. Zwar gibt es Kontraindikationen für die angegebenen NME im klinischen Populationen, einschließlich der peripheren venösen Erkrankungen oder maligne Erkrankungen, zum Beispiel, ist NMES sicher und machbar, auch für diejenigen, die krank und / oder bettlägerig sind und für die Bevölkerung, in denen strenge Ausübung eine Herausforderung sein kann.

Hier zeigen wir, das Protokoll zur Anpassung der im Handel erhältlichen Elektroden und der Durchführung einer NMES-Protokoll mit einem Maus-Modell. Dieses Tiermodell hat den Vorteil der Verwendung eines klinisch verfügbare Gerät und ein sofortiges Feedback hinsichtlich Positionierung der Elektrode, um den gewünschten Muskel kontraktile Wirkung zu entlocken. Für die Zwecke dieses Manuskripts, beschreiben wir das Protokoll zur Muskelstimulation der vorderen Abteil Muskeln einer Maus Hinterlauf.

Protokoll

1. Vorbereitung der Elektrode

• Schneiden Sie ein 1 cm x 1 cm Abschnitt des Vektors Platine.
• Stabilisieren 2 Drahtwickelstützen Stifte in eine Schraubzwinge Griff, mit Stiften Abstand von etwa 3,5 mm voneinander entfernt. Die gegabelten Enden der Stifte sollte nach oben zeigen.
• Beugen Sie Drahtwickelstützen Pins im 90 °-Winkel, etwa auf halbem Weg entlang ihrer Länge, mit Spitzzange.
• Setzen Sie die Kupferdrähte von Konnektoren, etwa 7 cm von der Lead-Verbindung, durch Strippen des Drahtisolierung.
• Löt einem der Kupferdrähte am gegabelten Ende eines der Drahtwickelstützen Stifte. Wiederholen Sie Schritt für das Löten anderen Drahtwickelstützen Stift.
• Ziehen Sie Schrumpfschläuche bei Lötverbindung zwischen Kupferleitungen und Gold Pins, um zu isolieren und zu stabilisieren. Erhitzen Sie den Schlauch mit der Lötspitze.
• Legen Sie die abgelötet Spitzen der Stifte in Drahtwickelstützen benachbarten Öffnungen des Steckbrett Platine.
• Sicherstellen, dass die Drahtwickelstützen Stifte parallel zueinander und sind strick durch das Steckbrett, dass die Spitzen den gleichen Abstand befinden, wenn durch die Platine platziert.
• Einbetten gelöteten Enden der Stifte in klarem Epoxy. Lassen Sie das Epoxidharz für etwa 10 Minuten zu heilen, oder bis es komplett trocken.
• Wiederholen Sie die Anwendung von Epoxid, bis die Stifte-und Vektor-Platine vollständig eingebettet sind, um die strukturelle Integrität und Zugentlastung der Zuleitungen bieten.
• Schleifen Sie das Epoxidharz mit einem Metall-Datei, um die Spitzen der Stifte Gold freizulegen.
• Benutzen Sie ein Multimeter, um sicherzustellen, dass die beiden Leitungen sind nicht elektrisch kurzgeschlossen und dass die Anschlussdrähte haben richtige Kontinuität
• Befestigen Sie die Elektrode führt von der NMES Gerät an weiblichen 2-Wege-Draht-Anschluss (Pomona Patchkabel).

2. Tierische Vorbereitung

• Tiere werden betäubt durch Inhalation mit 2% Isofluran (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) in 100% O _2-Gas. Das Tier sollte bleiben während t narkotisiertener NMES Sitzung.
• Vor Beginn der NMES Protokoll auszuführen eine Zehe Quetschung um sicherzustellen, dass das Tier betäubt vollständig ist.
• Tiere sollten regelmäßig auf Reaktion auf die Stimulation überprüft werden, um sicherzustellen, das Anästhetikum ausreichend ist. Die Narkose sollte nach Bedarf eingestellt werden. Bewegung außer, dass der stimulierten Bein, Änderungen in Atmungstiefe und die Farbe des Schleimhäuten alle regelmäßig geprüft werden, um Narkosetiefe überwachen.
• Positionieren Sie das Tier in Seitenlage.
• Apply Augen Schmiermittel für die Augen, um die Hornhaut Trocknung während des Verfahrens zu verhindern.
• Rasieren Sie den hinteren Gliedmaßen zu behandelnden Fläche, und wischen Sie mit Alkohol.
• Wischen Sie die Elektrode mit 3% Bleichmittel, dann mit Wasser abspülen.
• Tragen Sie eine Schicht aus leitendem Gel über der Stelle, wo die Elektrode aufgebracht werden. Wenden nach Bedarf während des NMES Protokoll, um den Stromfluss zwischen der Elektrode und der Haut sicherzustellen.
• Eine Wärmelampe or Zirkulationswasserbad Decke sollte verwendet werden, um normale Körperkerntemperatur Bereichen aufrecht zu erhalten.
• Hinweis: Alle Verfahren wurden überarbeitet und von der University of Pittsburgh Institutional Animal Care und Use Committee gebilligt und trat in PHS versichert und AAALAC Int. akkreditiertes Programm und Einrichtungen.

3. Stimulation

• Platzierung der Elektroden:
  • Für die Stimulation der vorderen Abteil Muskeln, einschließlich des M. tibialis anterior und dem M. extensor digitorum longus, legen Sie die Oberfläche Elektrode direkt über das Tier N. peronaeus profundus, die eine distale Abzweigung des N. peronaeus ist, und befindet sich unmittelbar vor dem die Fibulaköpfchen.
  • Für die Stimulation der vorderen Abteil Muskeln, wird die Platzierung der Elektrode bestätigt, wenn eine Stimulation auslöst volle Dorsalflexion und voller Streckung der Finger. Auf der anderen Seite, Dorsalflexion, in Abwesenheit von Stellenerweiterung vermuten, dass nur der Tibialis anterior Muskel wird angeregt. Eine solche gezielte Kontraktionsreaktion kann es wünschenswert sein, je nach Studiendesign.
  • Ein frei beweglicher, konzentrische Phase, die während der anfänglichen auftritt ~ 0,5 Sekunden: Die Muskelkontraktion ist in 2 Phasen unterteilt Stimulation. Während dieser ersten Phase bewegt sich die Pfote aus einer Ruheposition, um eine maximale Dorsalflexion und stelligen Durchwahl. Die zweite Phase der Stimulation ist eine isometrische Kontraktion bei End-Bereich und Dorsalflexion stellige Erweiterung entstanden sind.
• Stimulationsparameter:
  • Dieses Modell nutzt die NMES 300 PV Empi Multifunktions-Elektrotherapie-Gerät, das zwei Kanäle konventionelles NMES (siehe Tabelle) zur Verfügung stellt. Für die Zwecke dieses Modell wird nur 1 Kanal.
  • Parameter verwendet werden, gehören symmetrische Wellenform, einer Pulsdauer von 150 us und einer Frequenz von 50Hz. Die Stimulation der Zeit ist auf 5 Sekunden gesetzt, mit einer Rampe 0,5 Sekunden bis 0,5 Sekunden und eine Rampe hinunter. Auf diese Weise können die Muskeln mehr schrittweise AkklimatisationKumpel auf die Stimulation. In der aktuellen Protokoll wurde in Aus-Zeit zwischen den Wehen auf 10 Sekunden eingestellt, aber dies kann in Abhängigkeit von der gewünschten Wirkung werden. Verminderte off-Zeiten wird in einer schnelleren Einleitung der Muskelermüdung führen. Diese Stimulationsparameter wurden auf klinische Protokolle entwickelt, um die Muskelkraft mit neuromuskuläre elektrische Stimulation zu erhöhen, ohne Anreize für beträchtliche Schäden Skelettmuskulatur ^{1, 15, 16} basiert.
  • Mäuse vervollständigen zwei Sätze von 10 Kontraktionen, mit einer 5 Minuten Pause zwischen den Sätzen.
  • Für erwachsene Tiere ist NMES Intensität typischerweise bei 9 mA initiiert. Aus unserer Erfahrung ist dies in etwa der maximalen Intensität ab, die nicht zu induzieren ist eine spürbare Beeinträchtigung Gang unmittelbar nach Stimulation. Für nachfolgende NMES Sessions, wird die Intensität um 1 mA jedes Mal, wenn die Tiere in der Lage, 20 voll dorsiflexions abzuschließen erhöht.
• Nach Abschluss der Stimulation und Reco-Protokollsehr aus der Narkose, Tiere weisen typischerweise eine normale Gang und Haltung. Gangwerk sollte während der gesamten Dauer des Programms NMES bleiben unbeeinträchtigt.

4. Repräsentative Ergebnisse

Wildtyp (B6/10), B6.SCID und MDX / SCID-Mäusen: Die NMES Protokoll in diesem Artikel beschrieben wurde in verschiedenen Mausstämmen, einschließlich umgesetzt worden. Repräsentative Ergebnisse der NMES über 4 Wochen (20 Sitzungen) in 3-5 Monate durchgeführt alten mdx / SCID werden vorgestellt.

Die Tiere wurden durch Genickbruch menschlich, während der Narkose euthanasiert. Die Tibialis-anterior-Muskel wurde geerntet und sofort eingefroren 2-methyl-butan in flüssigem Stickstoff vorgekühlt, und bei -80 ° C Serielle Querschnitte (10 um) wurden erhalten und montiert auf Objektträger. Statistische Analysen wurden durchgeführt unter Verwendung von Standard Statistik-Softwarepakete (SPSS, V19.0 Software). Zunächst wurde Levene-Test verwendet werden, um zu beurteilen, ob es was Gleichheit der Varianzen. Unabhängige Proben t-Test wurde dann durchgeführt, um Unterschiede zwischen NMES und Kontrollgruppen zu untersuchen.

Hämatoxylin und Eosin (H & E) Flecken wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob die NMES Protokoll würde zu einer erhöhten Verletzungsgefahr im dystrophischen Muskel führen. Ein Abschnitt gewählt wurde, und Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop (Nikon Eclipse E800; Nikon, Japan). Die Gesamtzahl der Fasern und der Anzahl der Fasern mit zentral gelegenen Kernen wurden manuell gezählt mit der National Institutes of Health (NIH) - entwickelten Bildanalyse-Software, Image J. Es gab keinen signifikanten Anstieg der Regeneration Index (Zahl der zentral kernhaltigen Fasern Abbildung 1); / Gesamtzahl der Fasern) in den Tieren vorgelegt NMES, als in der Kontrollgruppe (p = 0,802 verglichen. Dies deutet darauf hin, dass die Anwendung NMES erhöht nicht die Degeneration-Regeneration Kaskade in dystrophischen Tieren beobachtet, und ist daher nicht wahrscheinlich,zu werden, induzieren eine erhöhte Muskel-Verletzungen.

Immunfluoreszenzfärbung für CD31 wurde durchgeführt, um die Wirkung der 4-Wochen-Protokoll NMES in Muskel Vaskularisation zu untersuchen. Kurz gesagt, wurden Muskel Abschnitte in 4% Formalin fixiert und blockiert mit 5% Pferdeserum (HS). Die Schnitte wurden mit einem Ratten-Anti-Maus-primären Antikörper (1:300 Verdünnung mit 5% HS) inkubiert und mit einer 555-markiertem Ziegen-Anti-Ratte sekundären Antikörper (1:300 Verdünnung mit 5% HS). Um die Anzahl der CD31-positiven Zellen zu quantifizieren, wurde ein Abschnitt ausgewählt ist, und fotografiert durch Fluoreszenzmikroskopie (Nikon Eclipse E800, Japan). Die Gesamtzahl der Kapillaren wurde manuell gezählt unter Verwendung von Northern Eclipse Software (Empix Imaging Inc.). Es gab eine signifikante Zunahme der Anzahl von CD31 positiven Zellen in der Tiere, die auf NMES zu Kontrollen (p <0,01; 2) verglichen wird, anzeigt, dass die NMES Protokoll beschrieben fördert Skelettmuskel Angiogenese.

In-situ-kontraktilen Test: Vier Wochen nach Abschluss einer NMES Protokoll wurde kontraktilen Prüfung der vordere Kompartiment Muskeln unter Verwendung eines in situ Prüfgerät (Modell 809B, Aurora Scientific Inc, Kanada), Stimulator (Modell 701C, Aurora Scientific Inc , Kanada), und Kraftaufnehmer (Aurora Scientific Inc, Kanada). Kurz gesagt wurde die peroneus von betäubten Tieren durch einen kleinen Schnitt quer zur Knie isoliert. Die Mäuse wurden dann in Rückenlage auf eine Plattform zu stellen und der Fuß getestet wurde auf der Fußplatte positioniert. Die hinteren Gliedmaßen zu Testzwecken verwendet wurde mit Gewebeband auf dem Knie und Fuß stabilisiert. Muskeln stimuliert wurden mit Hilfe eines Hakens Elektroden unter der Haut eingesetzt. Muscle tetanische Kontraktion wurde bei einer Frequenz von 150 Hz für 350 ms getestet, um zu untersuchen, ob die 4-wöchige NMES Protokoll würde Verbesserungen der Muskelkraft zu induzieren. Die Ergebnisse wurden mit feuchten Muskel Gewicht normalisiert. Es gab einen ca. 30% ige Erhöhung der tetanic Kontraktion der Tiere, die auf NMES, wenn die Kontrollen (p = 0,005) (Abbildung 3) verglichen, was auf die beschriebene Protokoll verbessert die Skelettmuskulatur Stärke in mdx / SCID-Tieren.

. Abbildung 1 Hämatoxylin & Eosin Färbung der Skelettmuskulatur dystrophischen (MDX) / immundefizienten Mäusen (4-5 Monate) (10fache Vergrößerung): a) unbehandelte Kontrollen, B) nach 4 Wochen NMES.

Abbildung 2. CD31 Immunfluoreszenz (rot), als Marker für die Durchblutung der Skelettmuskulatur, in der Skelettmuskulatur von dystrophischen (MDX) / immundefizienten Mäusen (4-5 Monate) (20-facher Vergrößerung) A) unbehandelte Kontrollen, B) nach 4 Wochen NMES.

Abbildung 3. Kontraktile Testsder vorderen Abteil Muskeln unter Kontrolle und Tiere mit NMES für 4 Wochen behandelt. mNm = milli Newtonmeter. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen .

Diskussion

Diese Ergebnisse legen nahe, dass unser entwickeltes Mausmodell der NMES Skelettmuskel Angiogenese (Abbildung 2) und Verstärkung (Abbildung 3) fördert, aber nicht induziert Skelettmuskel Schaden (Abbildung 1).

Es sei darauf hingewiesen, dass die Stimulation hier beschriebenen Parameter wurden entwickelt, um einen Muskel Überlastung zu den vorderen Kammer Muskeln zu induzieren. Wie es der Fall für die klinische Situationen kann Elektrodenplatzierung eingestellt auf andere Muskelgruppen zu stimulieren, wenn der Muskel Reaktion auf NMES verschieden sein können, je nach Faserzusammensetzung werden. NMES Dauer, Anzahl der Behandlungen, und die Gesamtzahl der Wiederholungen kann entsprechend dem Studiendesign geändert werden.

Wie bei jedem Protokoll, hat dieses Verfahren Einschränkungen, die beachtet werden sollte. In der vorliegenden Studie wurde die Stimulation über den N. peronaeus profundus durchgeführt. Doch in der Klinik, Stimulation is typischerweise an der Motoreinheit verabreicht. Im Tiermodell, würde Stimulation des Nervs einen niedrigeren Intensität, um eine vollständige Muskelkontraktion hervorzurufen. Eine weitere Einschränkung des Modells vorgestellt ist, dass wir keine Informationen bezüglich Komfort bei der Anwendung von NMES zu erhalten sind, da die Tiere betäubt sind. Deshalb ist die Verträglichkeit von vergleichbarer Intensität in einer klinischen Population schwer zu beurteilen. Allerdings deuten unsere Ergebnisse unserer histologischen NMES Modell, wie beschrieben, nicht induziert Muskelverletzung.

Die Entwicklung von Modellen, die Modalitäten Tiere üblicherweise in der Klinik umgesetzt liefern uns nützliche Tools, die im Labor für ein besseres Verständnis der zellulären und molekularen Ansprechen auf die Behandlung Interventionen können zu imitieren. Darüber hinaus sind solche Modelle sinnvoll, prä-klinischen Studien, sowohl zu verfeinern bestehenden Reha-Protokolle und entwickeln neuartige Indikationen durchzuführen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Vector Wire-Wrap-Pfosten mit gegabelten Lötanschluss	Newark	T68
Vector Platine	Newark	3662-2
Pomona Patchkabel	Newark	P-36-0
5 Minuten Epoxy	VO Baker Co.	4001
Spectra 360 Elektrodengel	Milliken Medical	MR41217
Tragbares Gerät neuromuskuläre Stimulation	EMPI	300PV