הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Summary

הטכניקה מתוארת בהרחבה על פתיחת מחסום דם מוח של עכבר באמצעות microbubbles ו אולטרסאונד. באמצעות טכניקה זו, מנגן יכול להינתן למוח עכבר. כי הוא מנגן חומר ניגוד MRI שמצטבר בנוירונים depolarized, גישה זו מאפשרת הדמיה של הפעילות העצבית.

Abstract

למרות עכברים הם מערכת מודל דומיננטי לחקר הבסיס הגנטי והמולקולרי של מדעי המוח, הדמייה תפקודית בעכברים נותר מאתגר מבחינה טכנית. גישה אחת, הפעלת-induced מנגן משופרת MRI (AIM-MRI), שימש בהצלחה למפות בפעילות העצבית מכרסמים ^1-5. במטרה MRI, Mn ^{2 +} פועל אנלוגי סידן מצטבר נוירונים depolarized ^6,7. בגלל Mn ^{2 +} מקצר את הנכס T ₁ רקמות, אזורי הפעילות העצבית גבוה ישפר ב-MRI. יתר על כן, Mn ^{2 +} מנקה לאט מאזורי הופעל, ולכן הגירוי יכול להתבצע מחוץ מגנט לפני הדמיה, מה שמאפשר גמישות רבה יותר ניסיוני. עם זאת, מאחר Mn ^{2 +} לא בקלות לחצות את המחסום שבין הדם למוח (BBB), הצורך לפתוח BBB הגביל את השימוש AIM MRI, בעיקר בעכברים.

אחד הכלים לפתיחת BBB הוא ultrasound. למרות שעלול להזיק, אם אולטרסאונד ניתנת בשילוב עם גז מלאות microbubbles (כלומר, בניגוד סוכני אולטרסאונד), לחץ אקוסטיות הנדרש לפתיחת BBB נמוך בהרבה. שילוב זה של אולטרסאונד microbubbles ניתן להשתמש באופן אמין לפתוח BBB מבלי לגרום נזק לרקמות ^8-11.

הנה, שיטת מוצג לביצוע MRI AIM באמצעות microbubbles ו אולטרסאונד כדי לפתוח את ד. לאחר הזרקה תוך ורידית של microbubbles perflutren, קרן ממוקדת אולטרסאונד פעמו יחול על ראש מגולח העכבר במשך 3 דקות. לשם הפשטות, אנו מכנים את הטכניקה הזו של פתיחה BBB עם microbubbles ו אולטרסאונד כמו BOMUS ^12. שימוש BOMUS לפתוח BBB לאורך שתי אונות המוח, מנגן ניתנת במוח העכבר כולו. לאחר הגירוי הניסיוני של עכברים מסוממים קלות, AIM-MRI משמש למפות את התגובה העצבית.

אללהדגים גישה זו, להלן BOMUS והמטרה MRI מהווים בסיס למיפוי גירוי מכני חד צדדי של vibrissae אצל עכברים מסוממים קלות ^13. בגלל BOMUS יכול לפתוח BBB ברחבי ההמיספרות הצדדים, הצד unstimulated של המוח משמש לשליטה על רקע גירוי ספציפי. מפת כתוצאה ההפעלה 3D מסכים גם עם ייצוגים שפורסמו האזורים vibrissae השדה לחבית קליפת ^14. פתיחת קולי של BBB הוא מהיר, לא פולשנית, ו הפיך, ולכן גישה זו מתאימה ללימודי תפוקה גבוהה ו / או אורך בעכברים ערים.

Protocol

1. להרכיב כיול מערכת אולטרסאונד

1. מערכת אולטרסאונד מתחיל מתמר יחיד אלמנט אולטרסאונד בקוטר רחב מספיק כדי לכסות את המוח העכבר תדר מרכז בטווח של 2 מגה הרץ. מתמר הוא מונע על ידי מגבר 50-DB-הכוח, אשר מחובר מחולל אותות שמייצר את רצף הדופק אולטרסאונד.
2. כדי לכייל את הלחץ האקוסטי של מערכת אולטרסאונד, להשתמש hydrophone להתייחס מתח להחיל את הלחץ שנוצר אקוסטי. מניחים את מתמר במיכל מים על hydrophone. החל דופק פשוט (למשל, sinusoid 10 מחזור בתדירות של מתמר בתדירות החזרה הדופק של הרץ 10) כדי מתמר. השתמש שלב 3-ציר תרגום למצוא את התגובה שיא, אשר אמור להיות במרכז של הקורה אולטרסאונד במוקד הטבעית של מתמר (כ 60 מ"מ על 13 מ"מ מתמר שלנו בקוטר 2.15 מגה הרץ).
3. לבצע מדידות על כמה צלצלהדואר של מתח הזנה (למשל, _{עמ '50-400} mV) כדי לאמת את הליניאריות של המערכת. השתמש רגרסיה ליניארית פשוטה להעריך את הקשר בין מתח הזנה ולחץ אקוסטית. במערכת שלנו, מתח הזנה של 258 ו - 167 mV _עמ תואם את שיא שלילי לחצים אקוסטיים של 0.52 ו 0.36 מגפ"ס.
4. תוכנית מחולל אותות לייצר הדופק אולטרסאונד רצף המורכב פרצי פולסים סינוסי בתדר מתמר עם 50,000 מחזורי להתפוצץ בכל תקופה פרץ של 64 מילישניות. בהתבסס על מדידות הכיול, לקבוע את המשרעת הדופק כדי לייצר שיא שלילי לחצים אקוסטיים של 0.36 מגפ"ס במרכז המיקוד הטבעית של מתמר.

2. להכין את ריאגנטים

1. ממיסים tetrahydrate כלוריד מנגן (MnCl ₂ · 4H ₂ O) של מים סטריליים בריכוז של 100 מ"מ (300 mOsM) ומסנן לעקר.
2. לייצר את השומנים microspheres perflutren ידי "activatinG "בקבוקון של תועמלן היצרן סיפק את 45 של. ליום של ניסויים, בקבוקון אחד יכול להיות מופעל פעם אחת בתחילת היום להשתמש בו ללא הפעלה מחדש עד סוף היום.
3. בסמוך לפני ממשל microsphere, להתסיס את הבקבוקון ביד דקות 1 עד resuspend microspheres. כאשר נסיגה microbubbles מבקבוקון, אל להזרים אוויר לתוך החדר בקבוקון, שכן הדבר מבזה את microbubbles הנותרים. השאירו את הבקבוקון מעמד עד השימוש האחרון של היום, ולאחר מכן לאחסן אותו במקרר. מתוחזק באופן זה, בקבוקון אחד יכול להימשך מספר ימים. להפעיל מחדש את הבקבוקון מאוחסנים מסית, לפני השימוש הראשון בימים הבאים.

3. בעלי חיים הכנה

1. להרדים את החיות עם isoflurane, מועברים על ידי חרטומו. המנגנון חרוט האף צריך להיות מתוכנן לתקן את ראשו של בעל החיים בדיוק ובאמינות באותה תנוחה כל הזמן. המכשיר שלנו ¹⁵ שומר על ראש הה "גולגולת שטוחה" העמדה (כלומר, המשטח הגבי הגולגולת הוא אופקי) המשמש את המוח Paxinos אטלס ^16. לכיל הרדמה כדי לשמור על קצב הנשימה בין 85 לבין 125 נשימות לכל דקה. לשמירה על חום גופם באמצעות מנורת חום או אוויר מנופחת. להגן על העיניים עם חומר סיכה.
2. להסיר את השיער מהקרקפת העכבר באמצעות גוזם חשמלי.
3. מניחים וריד הזנב קטטר קטטר intraperitoneal (IP). לימודי הישרדות, הקפד להשתמש בטכניקה סטרילית מתאימה; מיקום קטטר IP הפגינו וידאו של מאמר זה הוא מתאים רק שאינם הישרדות ניסויים.
4. ערוך את כל ההכנות נוספים הנדרשים לצורך הניסוי גירוי עצבי. למיפוי של גירוי vibrissae של קליפת בתחום לחבית, במיקרוסקופ לנתח ומספריים microsurgical לחתוך vibrissae קרוב ככל האפשר אל פני העור ללא זקיק מעצבן או העור שמסביב.
5. אולטרסאונד במקום ג'ל עלהקרקפת ולאחר מכן נמוך עמודת המים הכיל ידי יריעת פלסטיק דקה (למשל, 7.6 מיקרומטר האשפה שקית אשפה) על ראשו. להגיע דרך עם עמודת המים עם כותנה שקצהו ספוגית לדחוף את כל בועות האוויר, כי להילכד בתוך ג'ל אולטרסאונד. מקם את מתמר אולטראסאונד במרחק המוקד הטבעי (58 מ"מ) ישירות על המוח העכבר בעמודה של מים, לנקות את מתמר עם קצה האצבע כדי להסיר בועות אוויר שנלכדו.

4. הדם למוח מכשול פתיחה עם microbubbles וסאונד Ultra (BOMUS)

1. תן זריקה intraperitoneal של פתרון מנגן במינון של ה-IP mmol / kg 0.5. כיסוי או קטטר intraperitoneal כך מנגן לא לזרום החוצה, ולחכות 10 דקות כדי לאפשר לו להפיץ (איור 1).
2. כדי לפתוח את BBB, לנהל 30 μL של perflutren השומנים microspheres (DEFINITY מופעל) באמצעות קטטר וריד הזנב, ובמקביל, לפתוח את רצף הדופק אולטרסאונד. גontinue insonification במשך 3 דקות.

5. גירוי עצבי

1. אפשר כ 40 דקות רמות המוח של Mn ^{2 +} לייצב לפני תחילת גירוי עצבי. בדרך זו, שיפור דרמטי המחקר עקב Mn ^{2 +} דיפוזיה פני BBB ניתן להבחין בין שיפור ההפרש עדין בשל גירוי. לאחר מכן, מתחיל גירוי עם הפרדיגמה של הבחירה שלך (איור 1).
2. לגירוי vibrissae, כבה את isoflurane ולהסיר את חרטומו. להעביר מכחול אמן רך באופן ידני בתנועה סיבובית (1-5 הרץ) באמצעות מערך vibrissae במרחק של כ 2-5 מ"מ מהעור. המשך גירוי דקות 90. מנגן יש אפקט מרגיע המאפשר גירוי בלתי מרוסנת של בעלי חיים. אם בעל החיים הופך להיות חסר מנוחה, לנהל 5% isoflurane דרך קונוס האף למשך כ 15 שניות.

6. Magnetiג תהודה

1. לאחר גירוי, לחדש את ההרדמה באמצעות חרטומו. המשך שמירה על טמפרטורת הגוף titrating רמת isoflurane לקצב הנשימה של 85-125-נשימות לדקה.
2. מניחים את העכבר על סליל הדמיה MR ולהעביר למערכת MRI. לרכוש ברזולוציה גבוהה 3D T ₁ משוקלל תמונות MR. לדוגמה, השתמש שיפוע מפונק 3D נזכר הד (SPGR) ברצף עם הפרמטרים הבאים: זמן החזרה של 25 מילישניות, זמן הד 2 ms, זווית של 30 מעלות השני של המטבע, רוחב פס של 15.63 קילוהרץ, שדה הראיה של 20 × 20 × 12 מ"מ; מטריצה ​​של 128 × 128 × 60.

7. ניתוח תמונה

1. ניתוח התמונה הוא ספציפי הפרדיגמה גירוי בשימוש. לצורך ניסוי גירוי vibrissae (איור 2), לייבא את התמונות מבעלי חיים שונים לסביבה ניתוח מתאים. אם בעלי חיים מסוימים היו מגורה בצד ימין, בעוד שאחרים היו מגורה בצד שמאל, פלורידהIP מסוימת, כך שכל התמונות בצורה יעילה "משמאל מגורה." לאחר מכן, כדי להשוות את הצד של המוח מגורה כל הצד הנגדי שלה unstimulated, צור כפולות שיקוף משמאל unstimulated סט התמונה נוצרת. לרשום את כל התמונות על משטח משותף, ואז להחליק אותם עם 3 × 3 × 3 הקרנל פיקסל גאוס.
2. לייצא את הנתונים לסביבה ניתוח מתמטי, כגון MATLAB. לחלופין, מסיכת האנטומיה רלוונטי מערכי נתונים של. עוצמת-לנרמל את התמונות בשיטת איטרטיבי של Venot et al. ^17,18.
3. השתמש, יחד חד זנב מבחן t להשוואת voxel כל הצדדים של המוח מגורה כל voxel הנגדי המתאים על הצדדים unstimulated של המוח כל אחד.
4. להציג את המפה כתוצאה p-value לזהות אזורים של פעילות ההפרש (איור 3).

8. נציג תוצאות

השיטה המוצגת כאן יש 2 קרן צעדים amental: (1) פתיחה BBB עם microbubbles ו אולטרסאונד (BOMUS) ו (2) הפעלת-induced מנגן משופרת MRI (AIM MRI). כי הצעד האחרון תלוי לשעבר, חשוב לוודא BOMUS יישום מוצלח.

שיבוש של מחסום דם מוח לאחר מתן _1-T קיצור חומר ניגוד (כגון מנגן או סוכן גדוליניום מבוסס) גורמת לעלייה של האות ב parenchyma המוח על T _{1-משוקלל} הדמיה בהשוואה המוח שבו BOMUS לא בוצעה (איור 4). חלוקת שיפור זה מנגן אינה אחידה לחלוטין, אם כי הוא עקבי למדי בין בעלי חיים. חלוקת משקף לא הומגניות רק פתיחת BBB, אבל גם היא הפצה מהותי לא אחידה של Mn בתוך המוח ^19. הדינמיקה במרחב ובזמן של פתיחת BBB תוארו עוד קודם לכן ^12.

אף אוזן גרון "> לאחר BOMUS יושמה בהצלחה, השלב הבא הוא לבצע AIM MRI פרדיגמות ניסויים רבים אפשריים:.. עם זאת, כי יש בלבול פוטנציאליים רבים, הפקדים וניתוח חייב להיות מתוכנן בקפידה תופעות בלבול כוללים הומוגניות פתיחת BBB, הצטברות הומוגניות של Mn במוח, הדינמיקה הזמני של דיפוזיה MN, ואת הפעילות העצבית ספציפי. בהפגנה זו, בתגובה לגירוי עצבי חד צדדי של vibrissae היה ממופה. כדי להסביר את inhomogeneities ו Mn השטף, הצד unstimulated של המוח בכל שימש שליטה פנימי. כדי להסביר את הפעילות העצבית ספציפי שעשוי להשתנות בין בעלי חיים, ניתוח סטטיסטי המשמש בדיקות כדי לזהות אזורים שהיו שונים באופן עקבי בין בעלי חיים (איור 2). התוצאות היו מפה תלת מימדי ההבדל תלת מימדי p-value המפה (איור 3), הצד הימני של אשר הצביעו על אזוריםהאות גבוה הנגדי כדי vibrissae מגורה. הצד השמאלי של המפה ציין אילו אזורים היה האות גבוה משמעותית ipsilateral כדי vibrissae מגורה. מפת p-value זיהו אזור רחב של אות גבוה הנגדי כדי vibrissae מגורה אשר תואם את השדה קנה בקליפה המוטורית הראשונית, אשר בתגובה לגירוי vibrissae תועדה באופן נרחב על ידי electrophysiology ^20,21 ו 2-deoxyglucose מחקרים. דיון מלא יותר של תוצאות אלה פורסמו בעבר ^13.

באיור 1. פרוטוקול ציר הזמן עבור הדמייה תפקודית עם BOMUS והמטרה MRI (מעובד מתוך Howles et al. ^13).

2. איור ניתוח תוכנית לזיהוי אזורים OF בעוצמה שונה בין הצדדים מגורה unstimulated של המוח כל אחד. כדי להשוות את הצד של המוח מגורה כל הצד הנגדי שלה unstimulated, כפולות שיקוף משמאל unstimulated סט התמונה נוצרת. תמונות אלו רשומות, מסונן מנורמל. לבסוף, מבחן משווה את התמונות שמאל מגורה משמאל unstimulated. מבחן t הוא "יחד", כך שהצד של המוח מגורה כל מושווה רק לצד unstimulated של המוח זהה. מבחן t הוא "חד זנב", כך שצד אחד של המפה p-value מציין האות גבוה משמעותית בצד גירוי של המוח, בעוד הצד השני של המפה p-value מציין האות גבוה משמעותית בצד unstimulated של המוח (מעובד מתוך Howles et al. ^13).

איור 3. תוצאות ניתוח משולב של 7 חיות בשני תפקידים שונים צירית. T הוא טור 1 מראה את הממוצע של כל התמונות רשומים מסודרים, כך למעשה כל העכברים היו vibrissae שמאל מגורה. את התמונות האלה הם כיסו עם מפה בצבע המציין את אחוז הגידול הממוצע של האות ב היחסי בכל voxel בחצי הכדור הנגדי, כפי שצוין על ידי בר צבע. אזורים צבעוניים בצד ימין של התמונה להראות היכן בחצי הכדור הנגדי לגירוי היה האות גבוה יותר. אזורים צבעוניים בצד שמאל של התמונה להראות היכן בחצי הכדור ipsilateral לגירוי היה האות גבוה יותר. עמודה 2 מציגה את אותן התמונות ועליהן מפת p-value המציין את המובהקות הסטטיסטית של עליית האות. טור 3 מראה את אותה מפה p-value מעולף על הדמויות המתאימות stereotaxic Paxinos אטלס ¹⁶ עם השדות חבית של בקליפה המוטורית מוצל (מעובד מתוך Howles et al. ^13).

/ 4055/4055fig4.jpg "/>
איור 4. הפריסה המרחבית של Mn ^{2 +} במוח. התמונות נרכשו 170 דק 'אחרי 0.5 מילימול / ק"ג IP MnCl ₂ מ BOMUS, טיפול (n = 5) ובקרה (n = 4) בעכברים. לאחר נורמליזציה, כלומר ומפות סטיית תקן חושבו (פאנל משמאל). שיפור היה גבוה יותר ב BOMUS שטופלו עכברים. למרות שיפור זה לא הייתה אחידה על פני המוח, זה היה עקבי למדי, למעט ליד הקצוות של המוח החדרים. באמצעות אזורים של עניין (ROIs) נמשך סביב מבנים שונים, יחס אות לרעש ממוצע (1 + SD) חושבה על פני כל קבוצה (פאנל מימין). BOMUS שטופלו בבעלי חיים הראו יחס אות לרעש גדול יותר אך גם שונות גדולה יותר בין מבנים ובין בעלי חיים (מעובד מתוך Howles et al. ^13).

איור 5. כדי לבחון את ההשפעות של רקמות BOMUS, המוח של עכברים שטופלו BOMUS תוקנו, sectioned ב 500 - מרווחי מיקרומטר, ו מוכתם hematoxylin ו eosin. מספר ממוצע של תאים אדומים בדם extravasations לראות כל חלק של המוח מוצג על הלחצים אקוסטיים של 0.36 מגפ"ס (n = 3), 0.52 מגפ"ס (n = 4), 5.0 מגפ"ס (n = 1). ברים שגיאה להראות שגיאה סטנדרטי. לוח 2 מציג דוגמה חמורה extravasation תא דם אדום מהמוח נחשף 5.0 מגפ"ס (מעובד מתוך Howles et al. ^12).

איור 6. בדיקות התנהגותיות כמותי שימש להערכת פעילות, עוררות, ואת ההיענות לפני ההרדמה, ו 3 ו -24 שעות לאחר ההתאוששות מן ההרדמה. שיטת הניקוד, תיאר בעבר ^12, התבסס על הערכה מבוססת העכבר כמותית התנהגותי לפתחאד על ידי אירווין ב -1968 ^22. התנהגות הממוצע (± SEM) ציון עבור (n = 3) ו BOMUS (0.36 מגפ"ס) טיפול (n = 8) בעלי חיים מוצג. ביחס לקו הבסיס טרום הרדמה, כל בעלי החיים מצביעים על ירידה בציון התנהגות 3 שעות אחרי הרדמה, אבל הם בעיקר להתאושש ביום הבא. בכל נקודת זמן, נראה הבדל בין שתי הקבוצות, המציין כי BOMUS לא מדידה משפיעה על התנהגות בעלי חיים (מעובד מתוך Howles et al. ^12).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, השיטה שהוצגה על noninvasively פתיחת BBB בכל רחבי המוח העכבר שלם עם אולטרסאונד microbubbles (BOMUS). עם פתוח BBB, Mn ^{2 +} היה מנוהל והפעלה הנגרמת מנגן משופרת MRI (AIM MRI) שימש בתגובה לגירוי עצבי התמונה קצר משך עכברים מסוממים קלות.

הפתיחה מספקת BBB הו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
Hydrophone	סונורה מערכות רפואיות, Longmont, CA	S4 SN-251
תרגום הבמה	חברת ניופורט, אירווין, קליפורניה
מתמר אולטראסאונד	אולימפוס NDT, Inc, Waltham MA	A306S-SU	סקור גיליון הבדיקה של היצרן המלווה את מתמר כדי למצוא את התדר המדויק של מרכז מתמר המסוים הזה, אשר עשוי להיות שונה בתדירות הנקוב בקטלוג. (לדוגמה, תדר נומינלי של מתמר שלנו היה 2.25 מגה הרץ, אבל התדירות מרכז בפועל היה 2.15 מגה הרץ).
Vevo הדמיה תחנה	VisualSonics, Inc בטורונטו, קנדה	;
50 dB מגבר כוח	E & I, רוצ'סטר, ניו יורק	דגם 240L
מחולל אותות	Agilent Technologies, סנטה קלרה, קליפורניה	דגם 33220A
MnCl 2 - (H2O) 4	סיגמא		משקל מולקולרי משתנה לפי אצווה, להתקשר ליצרן למדידה מדויקת
Perflutren השומנים microspheres	Lantheus הדמיה רפואית, נ 'Billerica, MA	DEFINITY
Microsphere מסית	Lantheus הדמיה רפואית, נ 'Billerica, MA	VIALMIX
MR סליל הדמיה	M2M הדמיה קורפ, הילקרסט, OH		35 נצב בקוטר מ"מ שידור / קליטה סליל נפח
מערכת ה-MRI	GE Healthcare, Milwaukeדואר, WI		GE קונסולת Excite ההפעלה 7-T אופקי מגנט משעמם
ניתוח התמונה הסביבה	הדמיה פניו, סן דייגו, קליפורניה, MathWorks, Natick תואר שני	עמירה MATLAB