Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Özet

A yöntemi genel mikro-kabarcıkların ve ultrason ile fare kan-beyin bariyerini açılması için tarif edilmiştir. Bu teknik kullanılarak, manganez fare beyin için uygulanabilir. Manganez depolarize nöronlarda birikerek bir MR kontrast madde olduğundan, bu yaklaşım nöronal aktivitenin görüntüleme sağlar.

Özet

Fareler nörobilim, farelerde işlevsel beyin görüntüleme genetik ve moleküler temelleri incelemek için egemen model sistem olmasına rağmen teknik açıdan zor kalır. Bir yaklaşım, Aktivasyon Bağlı Manganez kontrastlı MRG (AIM MRG), kemirgenler ^1-5 nöronal aktivitenin eşleştirmek için başarıyla kullanılmaktadır. AIM MRG yılında, Mn ^{2 +} kalsiyum analog davranır ve depolarize nöronlarda ^6,7 birikir. Mn ^{2 +} T ₁ doku özelliğini kısaltır Çünkü, artmış nöronal aktivitenin bölgelerinde MRG'de artıracaktır. Dahası, Mn ^{2 +} aktifleştirilmiş bölgelerden yavaş temizlenir ve bu nedenle, uyarılması daha deneysel bir esneklik sağlayan, önceden görüntüleme için mıknatıs dışında gerçekleştirilebilir. Ancak, Mn ^{2 +} kolaylıkla özellikle farelerde kan-beyin bariyeri (KBB), BBB AIM MRG kullanımı sınırlı olan açmaya gerek, çapraz değil çünkü.

BBB açılması için tek araç olduğunu Ultrasound. Zararlı olsa ultrason gazlı kabarcıkların (yani, ultrason kontrast ajanlar) ile birlikte uygulandığında ise, BBB açılması için gerekli akustik basınç oldukça düşüktür. Ultrason ve kabarcıkların Bu kombinasyon güvenilir bir şekilde doku hasarının yol açmadan ^8-11 bbb açmak için kullanılabilir.

Burada bir yöntem BBB açmak için mikro kabarcıklar ve ultrason kullanılarak MRG AIM gerçekleştirmek için sunulmuştur. Perflutren kabarcıkların intravenöz enjeksiyonu takiben, bir Odaksız darbeli ultrason dalgaları 3 dakika boyunca traş fare kafası için uygulanır. Kolaylık için, biz Mikrobaloncuklar ve BOMUS ¹² olarak Ultrasound ile BBB Açılış bu tekniği bakın. Her iki serebral hemisfer boyunca BBB açmak için BOMUS kullanarak, manganez tüm fare beyin uygulanır. Hafif sedasyon farelerde deneysel stimülasyon sonra, AIM MRG nöronal yanıtı eşlemek için kullanılır.

IçinBu yaklaşım göstermek, burada BOMUS ve AIM MRG ¹³ hafif sedasyon farelerin burun kılı tek taraflı mekanik stimülasyonu eşleştirmek için kullanılır. BOMUS iki beyin yarı küresine boyunca bbb açabilir, çünkü, beyin unstimulated yan spesifik olmayan arka uyarılması için kontrol etmek için kullanılır. Elde edilen 3D aktivasyon haritası varil alan korteksin ¹⁴ burun kılı bölgelerinin yayınlanan temsilcilikleri ile de kabul eder. Bbb bir ultrasonik açılması, hızlı invaziv olmayan ve tersine çevrilebilir ve bu nedenle bu yaklaşım uyanık farelerde yüksek verim ve / veya uzunlamasına çalışmalar için uygundur.

Protokol

1. Ultrason Sistemi kurma ve kalibre

1. Ultrason sistemi 2 MHz aralığında farenin beyin ve merkezi frekans kapsayacak kadar geniş bir çapa sahip tek bir eleman ultrason probu ile başlar. Transdüser ultrason darbe dizisi üreten bir sinyal jeneratörüne bağlı olan bir 50 dB-güç amplifikatörü tarafından tahrik edilir.
2. Ultrason sisteminin akustik basınç kalibre edilmesi, sonuçta meydana gelen akustik basınç uygulanan gerilim ilişkili bir hidrofon kullanabilir. Hidrofon üzerinde bir su tankına transdüktör yerleştirin. Dönüştürücü basit bir darbe (örneğin, 10 Hz darbe tekrarlama frekansı ile transdüserin frekansta 10 döngüsü sinüzoidin) uygulayın. Transdüserin doğal odak (bizim 13 mm çapında 2.15 MHz transduser için yaklaşık 60 mm) ultrason demetinin merkezinde olmalıdır pik yanıtı bulmak için, 3-eksenli çeviri aşamasında kullanın.
3. Çaldı üzerinde çeşitli ölçümler olunSistemin doğrusallık doğrulamak için girdi voltajı e (örn., 50-400 mV _s). Giriş gerilimi ve akustik basıncı arasındaki ilişkiyi tahmin etmek için basit lineer regresyon kullanın. Bizim sistemde, 258 ve 167 mV _pp giriş gerilimleri 0.52 ve 0.36 MPa pik negatif akustik baskılara karşılık geldi.
4. Program sinyal jeneratörü 50000 patlama başına döngü ve 64 ms bir patlama dönemi ile transdüser frekansta sinüzoidal darbe patlamaları oluşan bir ultrason darbe dizisi üretmek için. Kalibrasyon ölçümleri dayanarak, dönüştürücü doğal odak merkezinde 0.36 MPa pik negatif akustik basınçları oluşturmak için darbe genlik ayarlayın.

2. Reaktifler hazırlayın

1. 100 mM (300 mOsm) ve filtre sterilize bir konsantrasyonda steril suda manganez klorid tetrahidrat (MnCl ₂ · 4H ₂ O) içinde çözülür.
2. "Activatin tarafından Perflutren Lipid mikroküreler üreting "45 s için üretici tarafından sağlanan karıştırıcı içinde flakon. deneylerin bir gün için tek bir şişe günün başlangıcında bir kez aktif ve günün geri kalanı için reaktivasyonu olmadan kullanılabilir.
3. Mikroküre uygulamadan hemen önce mikroküreler tekrar süspansiyon için 1 dakika elle flakon çalkalayın. Bu kalan kabarcıkların alçaltır olarak tüpten kabarcıkların Geri çekerken, flakon içine oda hava enjekte etmemektedir. Günün son kullanıma kadar flakon dışarı bırakın ve sonra buzdolabında saklayın. Bu şekilde sürdürdü, tek bir şişe birkaç gün sürebilir. Önceki sonraki günlerde ilk kullanımdan, karıştırıcı saklı flakon yeniden etkinleştirin.

3. Hayvan Hazırlık

1. Burun konisi tarafından teslim, izofluran ile hayvanları uyutmak. Burun konisi aparat aynı konumda her zaman hassas ve güvenilir hayvanın başını düzeltmek için dizayn edilmelidir. Bizim cihaz ¹⁵ th kafa tutare Paxinos beyin atlası ¹⁶ kullanılan "kafatası-düz" pozisyonu (yani, dorsal kafatası yüzeyi yatay). 85 ve 125 nefesleri dakika başına arasında bir solunum hızı korumak için anestezik titre edilir. Isı lambası veya hava üflemeli kullanarak vücut ısısını korumak. Yağ ile gözleri koruyun.
2. Elektrikli bir düzeltici kullanarak fare derisi saç çıkarın.
3. Bir kuyruk ven kateter ve intraperitoneal (IP) kateter yerleştirin. Sağkalım çalışmalar için, uygun steril tekniği kullanmak emin olun; Bu yazı için videomuzda IP kateter yerleştirilmesi sadece sivil hayatta deneyler için uygundur.
4. Nöronal stimülasyon deney için gerekli olan tüm ek hazırlıkları yapmak. Namlu alan korteksin burun kılı stimülasyon haritalama için, tahriş folikül veya çevresindeki deri olmadan mümkün olduğunca yakın deri yüzeyine burun kılı kesmek için bir mikroskop ve mikrocerrahi makas kullanın.
5. Yerleştirin ultrason jelisaçlı deri ve sonra baş üstüne ince bir plastik levha (örneğin, 7.6 mikron çöp çöp torbası) tarafından bulunan düşük bir su sütunu. Ultrason jeli içinde sıkışıp olsun hava kabarcığı dışarı itmek için bir pamuk uçlu çubuk ile su sütunu ile ulaşın. Fareyi doğrudan beyin üstü su sütununda doğal odak mesafesi (58 mm) ve ultrason probu yerleştirin ve herhangi bir hava kabarcığı kaldırmak için bir parmak ucu ile transdüser silin.

4. Mikrobaloncuklar ve Ultra Sound (BOMUS) ile kan-beyin bariyeri Açılış

1. 0,5 mmol / kg IP dozunda manganez çözeltinin bir intraperitonal enjeksiyon verir. Manganez akmaya ve (Şekil 1) dağıtmak için izin 10 dakika beklemez yani periton kateteri kap.
2. BBB açmak için kuyruk damarından kateter ile Perflutren Lipid mikroküreler (aktive DEFINITY) 30 uL yönetmek ve aynı anda, ultrason darbe dizisi başlatabilir. C3 dakika boyunca insonification ontinue.

5.. Nöronal Stimülasyon

1. Mn ² beyin düzeyleri için yaklaşık 40 dakika bekleyin ⁺ sinirsel uyarılma başlamadan önce stabilize etmek. Bu şekilde, Mn ² nedeniyle donanımın dramatik bir baz bbb boyunca ⁺ difüzyon uyarılması sonucu ince bir ayırıcı geliştirme ayırt edilebilir. Daha sonra, seçtiğiniz paradigma (Şekil 1) ile stimülasyon başlar.
2. Burun kılı uyarılması için, izofluran kapatın ve burun konisi kaldırın. Deriye yaklaşık 2-5 mm uzaklıkta burun kılı dizi boyunca dairesel bir hareket (1-5 Hz) elle yumuşak bir sanatçının fırça taşıyın. 90 dakika süre ile uyarılması devam etmektedir. Manganez hayvan sınırsız stimülasyon sağlayan bir sakinleştirici etkisi vardır. Hayvan huzursuz olursa, yaklaşık 15 saniye süreyle burun konisi ile izofluran% 5 yönetmek.

6. Magnetic Rezonans Görüntüleme

1. Stimülasyon sonra, burun konisi ile anestezi devam. Vücut ısısını korumak ve 85-125 nefesleri dakika başına bir solunum hızı için izofluran düzeyini titre devam edin.
2. Bir MR bobin fare yerleştirin ve MRG sistemine aktarabilirsiniz. Yüksek çözünürlüklü 3D T ₁ ağırlıklı MR görüntüleri elde edin. Örneğin, aşağıdaki parametreleri ile eko (SPGR) dizisini hatırlattı 3D spoiled gradient kullanın:; 2 ms eko zaman; 30 derecelik çevirme açısı; 15.63 kHz bant genişliği; 25 ms tekrarlama süresi 20 bakış × 20 × alanı 12 mm, 128 × 128 × 60 matrisi.

7. Image Analysis

1. Görüntü analizi, kullanılan uyarı paradigma özgüdür. Burun kılı stimülasyon deneme için (Şekil 2), uygun bir analiz ortamı içine birkaç hayvanların görüntüleri aktarmak. Diğerleri sol, fl ile motive ederken, bazı hayvanların sağ uyarılmış olsaydıip tüm görüntüleri etkili bir "sol-uyarılmış." olduğunu bu nedenle bazı Sonra, onun kontralateral unstimulated tarafına her beynin uyarılan tarafı karşılaştırmak için, bir çoğaltılamaz ve sola unstimulated görüntü kümesi oluşturulur yansıtılmış oluşturun. Ortak bir alana tüm görüntüleri kayıt ve daha sonra bir 3 × 3 × 3 piksel Gauss çekirdek onları düzeltmek.
2. Böyle MATLAB gibi bir matematiksel analiz çevre, veri verir. İsteğe bağlı olarak, veri setleri alakasız anatomi maskeleyebilir. Venot ark iteratif yöntemi ile görüntülerin yoğunluğu-normalize. ^17,18.
3. Her beyin unstimulated tarafta karşılık gelen karşı voksel her beyin uyarılmış kenarlarının her voksel karşılaştırmak için bir eşleştirilmiş, tek-yönlü t testi kullanabilir.
4. Diferansiyel faaliyet bölgeleri (Şekil 3) tanımlamak için sonuç p-değeri haritasını görüntüleyin.

8. Temsilcisi Sonuçlar

Burada sunulan yöntemi iki fonu var amental adımları: Mikrobaloncuklar ve Ultrasound (BOMUS) ile (1) BBB Açılış ve (2) Aktivasyon Bağlı Manganez kontrastlı MRG (AIM MRG). Sonraki aşamanın eski bağlıdır, bunun nedeni başarılı bir şekilde uygulanması BOMUS doğrulamak için önemlidir.

T _1-kısalma kontrast madde (örneğin manganez veya gadolinyum bazlı ajan olarak) T beyin dokusunda bir sinyal artışı _{1-ağırlıklı} görüntüleme sonuçlarının uygulanmasından sonra kan-beyin bariyerinin bozulması beyinleri göre hangi BOMUS içinde (Şekil 4) yapılmadı. Bu hayvanlar arasında oldukça tutarlı olmasına rağmen, bu manganez donanımın dağıtımı, tamamen aynı değildir. Bbb dağıtım deliğine sadece homojen olmayan yansıtır, fakat, aynı zamanda beyin içindeki ¹⁹ Mn intrinsik düzgün olmayan bir dağıtımdır. BBB açılış zamansal ve mekansal dinamikleri daha önce ¹² tarif edilmiştir.

ent "> BOMUS başarıyla uygulanmaktadır edildikten sonra, bir sonraki adım AIM MRG gerçekleştirmek için pek çok deneysel paradigmalar mümkündür;.. Ancak, birçok potansiyel karıştırıcı etkileri, kontrol ve analiz olduğundan dikkatle tasarlanmış olmalıdır Karıştırma etkisi homojen BBB açılması dahil, beyin, Mn difüzyon zamansal dinamiği ve nonspesifik nöronal aktivitedeki Mn homojen olmayan bir birikimi. Bu gösteri de, burun kılı tek taraflı uyarılması nöronal yanıt haritası çizilmiştir. homojen olmayan düzensizlikleri ve Mn akı, her beynin unstimulated tarafı dikkate almak için Dahili bir kontrol olarak kullanılmıştır. hayvanlar arasında değişebilir spesifik olmayan nöronal aktivitenin dikkate almak için, hayvanlar analizi (Şekil 2) arasında sürekli farklı olduğu bölgelerin tanımlanması için istatistiksel test kullanılabilir. sonuçlar, üç boyutlu bir farklılık haritası ve bir edildi , üç boyutlu bir p-haritası değerine (Şekil 3), bölgeler belirtildiği üzere sağ tarafındauyarılmış burun kılı kontralateral yüksek sinyal. Haritanın sol tarafında bölgeleri uyarılmış burun kılı ipsilateral anlamlı derecede yüksek sinyal içinde olduğu belirtilir. P-değeri haritası yanıt stimülasyon yoğun elektrofizyoloji ^20,21 ve 2-deoksiglukoz çalışmalarla belgelenmiştir burun kılı için primer duyusal kortekste, varil alanına tekabül uyarılmış burun kılı kontralateral yüksek sinyal geniş bir bölgeyi belirledi. Bu sonuçlar daha kapsamlı bir tartışma daha önce ¹³ yayımlanmıştır.

Şekil 1. BOMUS ve AIM MRG (Howles ark uyarlanmıştır. ¹³⁾ ile fonksiyonel beyin görüntüleme için protokol zaman çizelgesi.

Bölgeler o belirlenmesi için Şekil 2. Analiz şemasıHer beyin uyarılır ve unstimulated taraf arasındaki f farklı yoğunluk. Onun kontralateral unstimulated tarafına her beynin uyarılan tarafı karşılaştırmak için, çoğaltılamaz ve sola unstimulated görüntü kümesi oluşturulur yansıyor. Bu görüntüler, kayıtlı filtre ve normalize edilir. Son olarak, testinde sol uyarılmış ve sola unstimulated görüntüleri karşılaştırır. Her beyin uyarılmış yan yalnızca aynı beyin unstimulated yan göre, böylece t testi "eşleştirilmiş" edilir. T testi p değeri haritanın diğer tarafında bir unstimulated tarafında daha yüksek sinyal gösterir iken p-değeri haritası bir tarafında, beynin uyarılan tarafında daha yüksek sinyal gösterir ve böylece "tek kuyruklu" dir beyin (Howles ark uyarlanmıştır. ^13).

Şekil 3. Iki farklı pozisyonlarda eksenel 7 hayvanların havuzlanmış analizi sonuçları. T O ilk sütun etkili tüm farelerin sol burun kılı uyarılan vardı, böylece hizalanmış tüm kayıtlı görüntülerin ortalama gösterir. Bu görüntüler, kontralateral hemisferde her voksel göreceli sinyal ortalama yüzde artış gösteren bir renk haritası ile overlaid olarak renk çubuğu ile gösterilir. Uyarılmasına kontralateral hemisferde yüksek sinyal vardı burada görüntünün sağ tarafında renkli bölgeleri göstermektedir. Stimülasyonu ipsilateral hemisferde yüksek sinyal vardı burada görüntünün sol tarafında renkli bölgeleri göstermektedir. İkinci sütun sinyali artışın istatistiksel anlamlılık gösteren p-değeri haritası ile kaplanmış aynı görüntüleri gösterilmektedir. Üçüncü sütun (Howles ark uyarlanmıştır. ¹³⁾ gölgeli duyusal korteksin varil alanları ile Paxinos stereotaksik atlas ¹⁶ karşılık gelen rakamlar üzerine işlenmiş aynı p-değeri haritasını gösterir.

/ 4055/4055fig4.jpg "/>
Şekil 4. ⁺ Beyin Mn ² mekansal dağılımı. Görüntüler (n = 5) ve kontrol (n = 4) farelerin BOMUS muamele 0.5 mmol / kg IP MnCl ₂ sonra 170 dakika satın alındı. Normalleşme sonra, ortalama ve standart sapma haritaları (sol panel) hesaplandı. Geliştirme BOMUS ile tedavi edilen farelerde daha fazlaydı. Bu geliştirme beyin boyunca tek değildi rağmen, beyin ve ventriküllerin kenarlarına yakın dışında, oldukça uyumlu idi. Çeşitli yapılar etrafında çizilen ilgi alanları (ROI) kullanarak, ortalama SNR (+ 1 SD) Her grup (sağ panel) üzerinden hesaplandı. BOMUS tedavi edilen hayvanların büyük SNR gösterdi ama aynı zamanda yapılar arasında ve hayvanlar arasındaki büyük farkı (Howles ark uyarlanmıştır. ^13).

Şekil 5. BOMUS doku etkilerini incelemek için, BOMUS tedavi edilen farelerin beyinlerinde tespit edildi, se500 ctioned - mikron aralıklarla ve hematoksilen ve eosin ile boyandı. Beynin, her bölümde görülen kırmızı kan hücresi Ekstravazasyon ortalama sayısına 0.36 MPa (n = 3), 0.52 MPa (n = 4), ve 5,0 MPa (n = 1) akustik basınçlar için gösterilmiştir. Hata çubukları standart hata gösteriyor. İkinci panel 5.0 MPa (Howles ark uyarlanmıştır. ¹²⁾ maruz beyinden gelen ağır kırmızı kan hücresi tahliyesini bir örneğini göstermektedir.

Şekil 6.. Kantitatif davranış testi anestezi öncesi aktivite, uyarılma ve reaksiyonunu değerlendirmek için kullanılan, 3 ve 24 saat Anesteziden sonra oldu. Skorlama sistemi, daha önce ¹² açıklanan köklü kantitatif fare davranışsal değerlendirme geliştirmeye dayanmaktadır1968 ²² Irwin tarafından ed. Ortalama davranış (± SEM) kontrolü için skor (n = 3) ve BOMUS (0.36 MPa) tedavi edilen (n = 8) hayvanlara gösterilmiştir. Öncesi anestezi taban göre, bütün hayvanlar 3 saat sonra anestezi Davranış puanı bir düşüş gösterir, ancak büyük ölçüde sonraki gün kurtarabilirsiniz. Her zaman noktasında, hiçbir fark BOMUS ölçülebilir hayvan davranışları (Howles ark uyarlanmıştır. ¹²⁾ üzerinde etkili olmadığını belirten, iki grup arasında görüldü.

Tartışmalar

Burada bir yöntem noninvaziv ultrason ve kabarcıkların (BOMUS) ile tüm fare beyin boyunca BBB açılması için sunuldu. BBB açıkken, Mn ^{2 +} uygulandı ve aktivasyon bağlı manganez kontrastlı MRG (AIM MRG) hafif sedasyon farelerde kısa süreli stimülasyon görüntü nöronal yanıtı için kullanıldı.

Yeterli BBB açılış 0.36 MPa pik negatif akustik basınç elde edildi. Not, bu ultrason ışının merkezinde derisi yüzeyinde basıncıdır. Tek eleman transdüseri...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hidrafon	Sonora Medical Systems, Longmont, CA	SN S4-251
Çeviri aşamasında	Newport Corporation, Irvine, CA
Ultrason dönüştürücü	Olympus NDT, Inc, Waltham MA	A306S-SU	Katalogda belirtilen nominal frekans farklı olabilir o dönüştürücü tam merkezi frekans, bulmak için dönüştürücü eşlik Üreticinin test sayfasını inceleyin. (Örneğin, bizim dönüştürücü nominal frekans 2,25 MHz, ama gerçek merkez frekansı 2.15 MHz idi.)
VEVO Görüntüleme İstasyonu	VisualSonics, Inc Toronto, Kanada	;
50 dB güç amplifikatörü	E & I, Rochester, NY	Model 240L
Sinyal jeneratörü	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	Model 33220A
MnCl 2 - (H2O) 4	Sigma		Molekül ağırlığı toplu göre değişir, tam ölçüm için üreticisini arayın
Perflutren lipid mikroküreler	Lantheus Tıbbi Görüntüleme, N. Billerica, MA	DEFINITY
Microsphere karıştırıcı	Lantheus Tıbbi Görüntüleme, N. Billerica, MA	VIALMIX
MR bobini	m2m Görüntüleme Corp, Hillcrest, OH		35 mm çapında dördün iletmek / ses bobini alıyorsunuz
MR sistemi	GE Healthcare, MilwaukeE, WI		7-T yatay delik mıknatıs işletim GE EXCITE konsolu
Görüntü analizi ortamı	Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA	Amira MATLAB