איטרטיבי אופטימיזציה של דופלקסים DNA להתגבשות של מכלולי SeqA-DNA

Summary

מבנה הגבישי של קומפלקסים-DNA חלבון יכול לספק תובנות לגבי תפקוד חלבון, מנגנון, כמו גם, את אופי האינטראקציה הספציפית. כאן, אנו מדווחים איך לייעל את האורך, רצף וקצוות של DNA דופלקס להתגבשות שיתוף עם חיידקי Escherichia SeqA, רגולטור שלילי של ייזום שכפול.

Abstract

Escherichia coli SeqA הוא רגולטור שלילי של שכפול הדנ"א שמונע פגי אירועי reinitiation לפי אשכולות GATC hemimethylated sequestering בתוך המקור של שכפול ^1. מעבר למקור, SeqA נמצא במזלגות שהכפולים, שבו הוא מארגן את ה-DNA המשוכפל חדשה למבנים מסודרים גבוהים יותר ^2. מקורבי SeqA רק בחולשה עם רצפי GATC בודדים, אבל הוא יוצר קומפלקסי זיקה גבוהות עם דופלקסים DNA המכילים אתרי GATC מרובים. היחידה התפקודית ומבנית המינימאלית של SeqA היא דימר, ובכך הסבירה את הדרישה של לפחות שני רצפי GATC כדי ליצור מורכבות-זיקה גבוהה עם DNA hemimethylated ^3. בנוסף, ארכיטקטורת SeqA, עם oligomerization ותחומי ה-DNA מחייבים מופרדים מקשר גמיש, מאפשרת מחייבת לחוזר GATC המופרד עד שלושה סיבובי סליל. לפיכך, הבנת הפונקציה של SeqA ברמה מולקולרית דורשת ana המבניתמוגה של SeqA חייבת רצפי GATC מרובים. בהתגבשות החלבון ה-DNA, ה-DNA יכול להיות אף להשפעה יוצאת דופן על אינטראקציות האריזה בהתאם לגדלים והארכיטקטורה היחסיים של החלבונים והדנ"א. אם החלבון הוא גדול יותר מאשר ה-DNA או טביעות רגליים של רוב ה-DNA, אריזת הגביש מתווכת בעיקר על ידי אינטראקציות בין חלבונים. לעומת זאת, כאשר החלבון הוא באותו גודל או קטן יותר מאשר DNA או שהוא מכסה חלק קטן של ה-DNA, ה-DNA DNA-DNA וחלבון האינטראקציות רק שולט אריזת גביש. לכן, התגבשות של קומפלקסים-DNA חלבון דורשת הקרנה השיטתית של ⁴ אורך הדנ"א ומסתיים DNA (בוטה או סככה) ^5-7. בדו"ח זה, אנו מתארים כיצד לעצב, לייעל, לטהר ולהתגבש דופלקסים DNA המכילים hemimethylated חוזר טנדם GATC במתחם בוריאצית dimeric של SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) כדי לקבל גבישים מתאימים לקביעת מבנה.

Protocol

1. טיהור חלבון

המקשר הגמיש חיבור N-(oligomerization) ו-C-מסוף (DNA המחייב) תחומי SeqA עזרי ההכרה חוזרת GATC hemimethylated המופרד 02:59 מדליק את ה-DNA. במחקר זה, שהייתי גרסה של dimeric SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) עם מוטציה נקודתית בתחום N-המסוף המונעת המשך oligomerization ומקשר קצר שמגביל את ה-DNA המחייבת לטנדם GATC חוזר מופרדת באופן בלעדי על ידי סיבוב אחד בדנ"א (איור 1) ^2,8.

1. מרה (DE3) BL21 תאים עם SeqA הקידוד פלסמיד תחת השליטה של ​​אמרגן T7,
2. צלחת השינוי בתגובת צלחות LB-אגר כולל 100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין,
3. פיק מושבות מעורבות לחסן תרבות לילה בקנה מידה הקטנה (תקשורת LB עם 100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין),
4. למחרת בבוקר לחסן 1 ליטר של מדיה באמצעות דילול של 1:100 overniתרבות ght,
5. לגדל את התאים לOD ₆₀₀ של ~ 0.7 ולגרום לייצור חלבון על ידי תוספת של איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של 1 מ"מ,
6. המשך הדגירה של 3 שעות ב 37 ° C עם רעד מסלולית ולאחר מכן לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה (10 דקות ב 3300 ז),
7. Resuspend תא הגלול במאגר הטיהור וlyse ידי sonication,
8. נקה lysate ידי צנטריפוגה (40 דקות ב 39000 ז) ולטעון את supernatant על עמודה מתאזנת עם חיץ הטיהור הפרין,
9. Elute SeqA באמצעות שיפוע ליניארי לM NaCl 1 (SeqA elutes ב ~ 0.7 מ 'NaCl),
10. ברכה את שברי SeqA המכילים יחד, לדלל להנמיך את העוצמת היונית של המדגם ועומס בעמודת כרומטוגרפיה קטיון מטבע מתאזן עם חיץ טיהור,
11. שימוש בשיפוע מלח ליניארי, SeqA הטהור elutes ב ~ 0.4 מ 'NaCl,
12. ברכה את שברי SeqA המכילים יחד, concentratדואר (3 מ"ג / מ"ל) וחנות במאגר האחסון.

2. טיהור DNA

1. להזמין oligonucleotides unmethylated והמפוגל משלימים מהחברה האהובה עליך,
2. ממס μmol 1 מתוך כל דנ"א גדיל הבודד lyophilized בשנת 800 μl של autoclaved DDH ₂ O, מערבולת ולתת לו לשבת במשך 10-20 דקות,
3. הוסף 800 μl של חיץ הטעינה 2X חומם מראש לכל oligonucleotide,
4. למשך 20-30 נוקלאוטידים oligonucleotides הארוך, להכין 10% ג'ל denaturing גדול (160 x 250 x מ"מ 1):
   * מערבב היטב 80 מ"ל של 10% תמהיל PAGE, TEMED 80 μl וpersulfate אמוניום μl 800 לג'ל ולשפוך,
   * מפולמר פעם, להסיר את המסרק ולשטוף את הבארות עם DDH ₂ O ביסודיות,
   * הרכיב את הג'לי על גבס ג'ל כולל צלחת קירור ולאחר מכן למלא את המאגרים העליונים ותחתונים עם ריצת חיץ (1X TBE),
   * מראש להפעיל את הג'ל ב700-750 V כדי לחמם את הג'ל עד 55 מעלות צלזיוס,
   * תפסיק לרוץ ולשטוף בארות thoroughly עם ריצת חיץ.
5. מחמם את oligonucleotides עד 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות,
6. מערבולת ולסובב את הדגימות ומייד לפני טעינת ג'ל,
7. הפעל את הג'ל ב~ 700 V ולעצור אותו הפעם אחת oligonucleotide הגר באמצע הדרך. (שים לב שעל 10% ג'ל polyacrylamide הכחול bromophenol שיתוף נודד עם oligonucleotides ~ 20 בסיסים ארוכים וקסילן cyanol FF עם ~ 60 בסיסים ארוכים),
8. עצור את הג'ל, לפרק אותו מתיבת ג'ל ולהסיר את המפרידים,
9. על משטח שטוח, הסר צלחת זכוכית אחת ולכסות את הג'ל בניילון נצמד,
10. הפעל את הג'ל בסביבה, להסיר את צלחת זכוכית האחרת ולכסות אותו בניילון נצמד,
11. סמן את הרצועות באמצעות אור UV וצלחת ניאון מאחורי הג'ל לראות את צל ה-DNA,
12. לחתוך את הרצועה בסכין גילוח לחתיכות קטנות ולהעביר אותם לתוך צינור מ"ל סטרילי 15,
13. הוסף 9 מ"ל של חיץ elution וelute לילה על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה,
14. בזהירות להעביר את הפתרוןלצינור צנטריפוגה autoclaved באמצעות קצה פיפטה ג'ל טעינה כדי למנוע חתיכות acrylamide מעבירים ולהוסיף 1 מ"ל של נתרן יצטט M 3 ב-pH 7 (1:10 דילול) בתוספת 25 מ"ל של אתנול 100% מצונן (2.5 כרכים),
15. דגירה ב -20 ° C לפחות 3 שעות,
16. ספין למטה ולהעביר את supernatant לצינור נפרד,
17. ייבש את הכדור במהירות-VAC בחום בינוני,
18. Resuspend גלול ב 400 μl של autoclaved DDH ₂ O ולהעביר לצינור טרי,
19. הוסיפו 40 μl יצטט M 3 נתרן בשעת 7 pH ו1 מ"ל של אתנול 100%; מערבב היטב (מערבולת) ודגירה 30 דקות בטמפרטורת חדר ואחרי 30 דקות ב -20 ° C,
20. ספין במשך 15 דקות ב18,000 גרמו וזורק supernatant,
21. שטוף את הכדור עם 100 μl של אתנול קר 70% להסיר מלח השיורי מהגלולה והספין ל6 דקות ב18,000 גרמו. השלך אתנול ולייבש את הגלולה במהירות-VAC,
22. Resuspend הגלולה בסך של 100 μl של autoclaved DDH _{2 O. למדוד את הריכוז של oligonucleotide,}
23. כדי לחשל את דופלקסים DNA hemimethylated, לערבב ריכוזי equimolar של גדילים המשלימים ולחמם את התערובות עד 95 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 5 דקות ולאחר מכן לתת להם להתקרר לטמפרטורת חדר באיטיות בתוך אמבט המים.

3. חלבון ה-DNA גיבוש וניתוח מורכב

1. לערבב כמויות שווות של המטוהרים SeqAΔ (41-59)-A25 (81 מיקרומטר) ודנ"א hemimethylated (81 מיקרומטר),
2. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים להשתמש בו,
3. מסך לתנאי התגבשות באמצעות מסכי מסחר דליל מטריצה,
4. ברגע שמוביל התגבשות ראשוני זוהה, לייעל את התנאים לגדל גבישים באיכות עקיפה,
5. Cryoprotect גבישי תוצאת SeqA-DNA או על ידי הגדלת הכמות של 400 הווה PEG בפתרון ההתגבשות לריכוז סופי של 25% (v / v) או הוספת גליצרול 20% (v / v) לפתרון ההתגבשות,
6. סקופ גבישים בודדים עם לולאת ניילון, ותקפיא אותם בחנקן נוזלי,
7. בדוק את גבול ההשתברות של כל גביש ב 100 ק

4. נציג תוצאות

כדי להשיג את המבנה הגבישי של SeqAΔ (41-59)-A25R הקשור ל-DNA hemimethylated, אנו רציפות מותאמת שלושה פרמטרים על ה-DNA: (i) הפרדה בין רצפי GATC hemimethylated (ii) אורך של הדופלקס וכן (iii) היעדרות / הנוכחות מסוכך 5 '.

מבחני משמרת אלקטרו ניידות עולים כי SeqAΔ (41-59)-A25R מעדיף נקשר חוזרת GATC מופרד 9-10 זוגות בסיסים (איור 1). לכן, אנחנו בהתחלה הוקרנו דופלקסים 23-24 זוגות בסיסים (סל"ש) ארוך המכילים שני רצפי GATC hemimethylated מופרד או 9 או 10 סיביים לשנייה. שלושה דופלקסים הניבו גבישים יפים בצורה (איור 2). אללמרות שאיש מגבישי diffracted לרזולוציה גבוהה, 23 bps הארוך דופלקס עם שני אתרי GATC המופרדים ב9 סל"ש מתפזר טוב יותר משאר צילומי רנטגן, המציין כי הפרדת GATC של 9 סל"ש הועדפה להתגבשות. לכן, סדר את המרווח בין GATC עד 9 סל"ש לכל המסכים שלאחר מכן.

באופן כללי, התגבשות DNA היא העדיף לאורכים מתאימים למדויקים סיבובי סליל דופלקס כי מולקולות דנ"א מרובות יכולות לערום את הראש אל זנב בצורת B-DNA מתמשך בתוך ⁹ גביש. לכן, אנו קצרנו את האורך הכולל של עד 21 דופלקסים סל"ש (שני סיבובים כלומר סליל). בעוד דופלקס 21 סל"ש עם קצוות קהים לא הניב גבישים עקיפים איכותיים (מידע לא מוצג), דופלקס 21 סיבי לשנייה עם סככת 5 'נוקלאוטיד יחידה בכל קצה לא תניב גבישים שמתפזרים כדי 5 A במקור הבית שלנו. השיפור בגבול ההשתברות הציע שקצה לקצה דופלקס עמותה אכן הייתה מעדיפהאריזת ing גביש.

מאז SeqA אינטראקציה עם רצפי GATC כי הם על אותו הפרצוף של ה-DNA, פן ההפוכות של הדופלקס הדנ"א צריכות להיות חשופות לממס. כדי לשפר עוד יותר את הגבישים של המתחם, אז אנחנו שונים הרצף של הדופלקס לכלול dinucleotide CG בין שני אתרי GATC לקדם אינטראקציות גרוב-עמוד שדרה עם מולקולות DNA סמוכות בגביש באמצעות הפנייה השנייה של דופלקס, שיטה שנעשה שימוש כדי לשפר את התגבשות DNA ^ב10 העבר. עם זאת, גבול ההשתברות של הגבישים גדלו עם דופלקס CG המכיל היה זהה לאלה שגדלו עם דופלקס דנ"א דומה שלא הכיל dinucleotide CG (איור 3). תוצאה זו מצביעה על כך שאינטראקציות גרוב-עמוד שדרה לא היו חשובות במקרה זה. אנחנו מכן מותאמים האורך של מסוכך על ידי השוואה בין הגבישים גדלו עם דופלקס דנ"א שהיו שני נוקליאוטידים נוספים בכל5 הסוף '. שינוי זה השפיע באופן דרסטי על מורפולוגיה גביש, כמו גם, גבול השתברות המציין כי נוקליאוטידים נוספים שינו את המגעים המולקולריים וארגון משופר גביש (איור 3) באופן דרמטי.

המבנה הגבישי של SeqAΔ (41-59)-A25R חייב דופלקס זו האחרונה דנ"א אשר כי הפנייה ללא דופלקס דנ"א אינה עוסקת בקשר של גביש, כצפוי מההשפעה המוגבלת של החדרת CG-dinucleotide. למרות הגודל היחסי של חלבונים ו-DNA, רוב האינטראקציות בין בני זוג סימטריה מתווכות על ידי אינטראקציות בין חלבונים וחלבון ה-DNA (איור 4). מעניין לציין שבמקרה הספציפי הזה, ההשפעה המועילה של סככת dinucleotide 5 'היא לא עקב ההיווצרות של DNA פסאודו רציף. במקום זאת, סופו 5 'מפרויקטי הגדיל המפוגלים הרחק מצירי DNA ומקיים אינטראקציה עם מולקולת SeqA הפרוקסימלי של המתחם, המסביר מדוע נוקלאוטידים 2 w פה נדרש להקפיד לשנות את גביש אריזה ^8,11.

איור 1. עקידת SeqAΔ (41-59)-A25R ל-DNA hemimethylated. () תרשים סכמטי של תחומי SeqA שoligomerization וDNA החלבון לתווך מחייב. (ב) assay electrophoretic ניידות המשמרת של SeqAΔ (41-59)-A25R עם DNAs המכיל שני רצפי GATC hemimethylated מופרדים על ידי מספר גדל והולך של זוגות בסיסים ( X). הנתיב השמאלי ביותר (שכותרת ריקה) מכיל תערובת של equimolar DNAs עם 5, 7, 12, 21, 25 ו 34 זוגות בסיסים בין שני רצפי GATC בהעדר SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) תרשים המתאר את השלושה המשתנים מותאמים על DNA דופלקסים להשיג גבישים באיכות עקיפה.

upload/4266/4266fig2.jpg "fo: תוכן רוחב =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg "/>
איור 2. השפעה של שינוי מרחק. הסיכום בין GATC של oligonucleotides משמש וגבישים שהושגו עם 23-24 דופלקסים ארוכים BP המכילים שני אתרי GATC hemimethylated המופרד ב9 או 10 זוגות בסיסים. כל התמונות של גבישים נלקחו באותו הגדלה וסרגל קנה המידה מציין 100 מיקרומטר. מגבלת הרזולוציה של כל SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA גביש מתבסס על תמונות שנאספו על עקיפת Rigaku RU-300 מערכת גנרטור רנטגן. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3. השפעה של שינוי DNA מסתיימת. סיכום של tהוא oligonucleotides שימוש, וגבישים שהושגו עם 21 bps דופלקסים ארוכים המכילים שני אתרי GATC hemimethylated המופרד ב9 זוגות בסיסים וכוללים 0, 1 או 2 מסוכך נוקלאוטיד 5 'קצה. כל התמונות של גבישים נלקחו באותו הגדלה וסרגל קנה המידה מציין 100 מיקרומטר. מגבלת הרזולוציה של כל SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA הגביש מתבסס על תמונות שנאספו בעקיפת beamlines X12C וX29 (NSLS, BNL). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 4. האריזה של SeqAΔ קריסטל (41-59)-A25R חייב DNA עם סככת dinucleotide: נצפה מ() למעלה ובצד (B). היחידה אסימטרית מכילה 2 SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA מתחמים שבו החלבון מוצג באפור תוך הדנ"א מוצג בכתום. Symmetר"י הקשור SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA מולקולות מוצגות בלבן והצהוב לחלבון ה-DNA. נתון זה הוכן באמצעות ¹² PyMOL. נתון זה קשור לסרט 1. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

סרט 1. לחץ כאן לצפייה בסרט.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אחד האתגרים הגדולים ביותר בקריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן הוא קבלת גבישים באיכות עקיפה. במקרה של חלבון או חלבון-DNA תסביכים, אתגר זה מתעצם בשל משתנים הנוספים שצריך להיות מותאמים. הוא האמין נרחב כי אורכו של ה-DNA ואת הנוכחות של מסוכך דביק כדי לשפר את הקשר בין מולקולות דנ"א ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	קטלוג #	תגובות (אופציונלי)
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)	הפישר סיינטיפיק	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	יו היסוד בע"מ	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
גליצרול	Caledon	5350-1
סוכרוז	סיגמה אולדריץ	S5016-500G
סולפט dodecyl נתרן (SDS)	Bioshop	SDS001.500
אוריאה	Bioshop	URE001.5
40% Bis 29:1 / acrylamide	יו היסוד בע"מ	A0007-500ml	לאחסן ב 4 ° C
חומצה בורה	EMD	BX0865-1
קסילן cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
בלו Bromophenol	Bioshop	BR0222
מערכת ג'ל כפולה מתכוונן אנכי	CBC המדעי חברה בע"מ	DASG-250
מסך התגבשות אינדקס	המפטון מחקר	HR2-144	לאחסן ב 4 ° C
מסך התגבשות אני אשף	אמרלד BioSystems	EBS-Wiz-1	לאחסן ב 4 ° C
מסך התגבשות השנייה אשף	אמרלד BioSystems	EBS-Wiz-2	לאחסן ב 4 ° C
קלאסיקות מסך התגבשות	Qiagen	130701	לאחסן ב 4 ° C
מגשי Intelliplate	אמנות רובינס מכשירים	102-0001-00
			פתרונות חיץ חלבון טיהור: 100 המ"מימ TRIS pH 8, 2 המ"מ EDTA, mM DTT 2 ו 5% גליצרול. חיץ חלבון אחסון: 20 המ"מ TRIS pH 8, 150 המ"מ NaCl, 5 המ"מ DTT, 0.5 המ"מ EDTA ו5% גליצרול. תמהיל ג'ל טעינה: הוסף 20 גרם של סוכרוז, 25 מ"ג של כחול bromophenol, 25 מ"ג של cyanol FF קסילן, 1 מ"ל של 10% w / v SDS ו10 מ"ל של TBE 10X עד 70 מ"ל של autoclaved DDH 2 O. מערבב עם חימום קל עד סוכרוז נמס ולהתאים הסופייםנפח עד 100 מ"ל עם autoclaved DDH 2 O. לאחסן ב 4 ° C. חיץ הטעינה 2X: הוסף 11 גרם של אוריאה עד 10 מ"ל של תערובת טעינת ג'ל. מערבב בצלחת חמה עד האוריאה מתמוססת. Aliquot ב 2 צינורות מ"ל ולאחסן ב 4 ° C. תמהיל העמוד 10X: מיקס 420.4 גרם של אוריאה, 100 מ"ל של TBE 10X (autoclaved), 250 מ"ל של 40% 29:1 Bis / acrylamide בDDH 2 O. מערבב עד שהיא נמסה לחלוטין ולהתאים את הנפח 1 ליטר. אחסן בבקבוקים כהים ב 4 ° C. TBE 10X: ממס 108 גרם לטריס, 55 גרם של חומצה בורה ו9.3 גרם של EDTA ב1 ליטר של DDH 2 O. חיטוי וחנות בטמפרטורת חדר. חיץ elution: לדלל 8 מ"ל של 5 M NaCl, 2 מ"ל של M TRIS pH 1 7.5, 0.4 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA pH 8 ב 200 מ"ל של DDH 2 O. חיטוי וחנות בטמפרטורת חדר.