הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

Summary

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

Abstract

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא שיטה בשימוש נרחב לקביעת יחסי הגומלין של חלבונים שונים עם ה-DNA בכרומטין של תאי חיים. דוגמאות לכך כוללות רצף ספציפי DNA מחייבים שעתוק גורמים, ההיסטונים ומצבי השינוי השונים שלהם, אנזימים כגון polymerases RNA וגורמים נלווים, ורכיבי תיקון DNA. למרות שכיחותה, קיים מחסור של up-to-תאריך, מתודולוגיות מפורטות להכנה גם הספסל של חומר ולניתוח מדויק המאפשר למדדי כמותיים של אינטראקציה. בשל חוסר זה של מידע, וגם כי, כמו כל immunoprecipitation, תנאים חייבים להיות מחדש מותאם לקבוצות חדשות של תנאי ניסוי, assay השבב הוא רגיש לתוצאות לא מדויקות או גרוע כמותי.

הפרוטוקול שלנו נגזר מסופו של דבר עבודת זרע בגורם שעתוק: אינטראקציות DNA ^1,2, אך משלב מספר השיפורים לsensitivity ושחזור לסוגי תאים קשים להשגת. הפרוטוקול שימש בהצלחה ^3,4, שניהם באמצעות qPCR לכמת העשרת דנ"א, או באמצעות גרסה חצי כמותית של להלן הפרוטוקול.

ניתוח כמו זה של חומר PCR-מוגבר מתבצע המחשוב, ומהווה גורם מגביל בassay. בקרות חשובות ושיקולים אחרים כוללים שימוש בנוגדן אלוטיפ בהתאמה, כמו גם הערכה של אזור שליטה של ​​הדנ"א הגנומי, כגון אזור גניים חזה לא להיות מחויבים לחלבון הנחקר (או צפוי שלא להציג שינויים תחת תנאי הניסוי). בנוסף, עקומת תקן של חומר הזנה לכל שבב היא מדגם המשמשת לחישוב רמות מוחלטות של העשרה בחומר הניסיוני. שימוש בעקומות סטנדרטיות עוזרת לקחת בחשבון את ההבדלים בין ערכות פריימר, לא משנה כמה הם נועדו בזהירות, וגם יעילות שונהences ברחבי הטווח של ריכוזי תבנית עבור קבוצת פריימר יחידה. הפרוטוקול שלנו הוא שונה מאחר, כי הם זמינים ^5-8 שבהרחבת כיסוי השלב מאוחר יותר, הניתוח.

Protocol

1. בידוד של CD4 נאיבי טחול עכבר תאי T

1. להקריב את העכבר בצורה הומנית בקנה אחד עם טיפול בבעלי חיים מוסדיים הוועדה השתמש (IACUC) פרוטוקולים. לנתח את הטחול ולמקם אותו בצלחת פטרי המכילה 10 מ"ל של DMEM עם 10% FBS.
2. לרסק את הטחול באמצעות קצוות חלבית של שתי שקופיות זכוכית כדי לשחרר את splenocytes. מעבירים את ההשעיה התא בצינור חרוטי 15 מ"ל.
3. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 (~ 1,200 סל"ד לצנטריפוגות קלינית בקוטר הרוטור אופייני) למשך 5 דקות ב 4 ° C.
4. תאי Resuspend בחיץ ACK 2 מ"ל לlyse תאי דם אדומים, 1 דקות בטמפרטורת חדר (RT). לעצור את התגובה על ידי הוספת 8 מ"ל של DMEM עם FBS.
5. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
6. Resuspend התאים 5 מ"ל של DMEM FBS המכיל ותעבור דרך 70 מיקרומטר רשת מסנן (BD פלקון, חתול # 352,350). ספירת התאים ולהמשיךלבידוד של CD4 הנאיבי תאי T מסוג CD4 בידוד באמצעות ערכה (Miltenyi, חתול # 130-095-248) באמצעות הוראות היצרן. תאי T מסוג CD4 לאסוף נאיביים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C. Resuspend התאים 10 מ"ל של DMEM עם FBS.

2. הכנה של הכרומטין

1. הוסף 37% פורמלדהיד לריכוז סופי של 1% להשעית התא בDMEM ועדינות הרוק ב RT (למשל באמצעות nutator) במשך 15 דקות DNA לחצות קישור: קומפלקסי חלבונים.
2. תפסיק crosslinking על ידי הוספת 1 M גליצין לריכוז סופי של 125 מ"מ. המשך לטלטל במשך 5 דקות ב RT.
3. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
4. לשטוף את התאים על ידי resuspending ב 5 מ"ל של מעכבי פרוטאז קרים כקרח PBS המכילים. שטוף במעכבי פרוטאז קר כקרח PBS המכילים 3 פעמים כוללים ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 4 ° C.
5. Resuspend תאי מיליליטר 1מאגר תמוגה תא קר כקרח המכיל מעכבי פרוטאז. לדגור על קרח במשך 15 דקות. היעילות של תמוגה תא יכולה להיקבע על ידי resuspending aliquot קטן של תאים בפתרון trypan כחול 0.4% (Sigma, חתול # T8154) והתבוננות עם מיקרוסקופ.
6. לאסוף את הגרעינים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 (בדרך כלל ~ 1,200 סל"ד) במשך 5 דקות ב 4 ° C. זורקי supernatant בזהירות.
7. Resuspend הגרעינים ב500 μl של חיץ תמוגה גרעיני המכיל מעכבי פרוטאז. לדגור על קרח במשך 15 דקות.
8. Sonicate התאים באמצעות sonicator Misonix 3,000, מ"מ גודל 1.6 בדיקה: רמת יציאת 4, פרץ 15 שניות, 4 פעמים על קרח. כל דגימה חייבת להיות מקוררת בקרח במשך 1-2 דקות לפני sonicating את זה שוב כדי למנוע התחממות יתר של דגימות. התחממות יתר יכול לגרום להיפוך של קישורים צולבים.
9. צנטריפוגה הכרומטין sonicated XG 16,000 (13,200 סל"ד ~ בmicrocentrifuge) במשך 5 דקות ב 4 ° C.
10. קח aliquot μl 20 של supern ברורatant, להוסיף צבע טעינת ה-DNA ולבדוק את ה-DNA sonicated ידי אלקטרופורזה באמצעות 2% agarose ג'ל (גודל אידיאלי של ה-DNA sonicated עבור רוב היישומים הוא 200-500 נקודות בסיס).
11. לקבוע את ריכוז ה-DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV. הכרומטין טעון ניתן להשתמש באופן מיידי כדי להגדיר את תגובת immunoprecipitation הכרומטין או מאוחסן ב -80 ° C. בדרך כלל אנו מקבלים DNA מיקרוגרם 7.5-10 2-3 X 10 ⁶ תאי T מסוג CD4 המטוהר לכל עכבר.

3. הכרומטין immunoprecipitation (כל השלבים חייבים להתבצע ב0-4 מעלות צלזיוס)

1. לדלל הכרומטין sonicated לריכוז ה-DNA של 5-10 מיקרוגרם / מ"ל ​​(נפח כולל = 1 מ"ל) במאגר דילול שבב עם מעכבי פרוטאז.
2. שמור μl 100 (10%) כקלט. אחסן על קרח.
3. Aliquot 450 μl כל לשני צינורות microfuge 1.7 מ"ל שכותרתו אלוטיפ שליטה (עכבר או הארנב IgG) ונוגדנים של עניין. אם נוגדנים מרובים של אותו אלוטיפ משמשים, contr אלוטיפ אחתol יהיה מספיק כדי לבצע את הניתוח הזה. תצטרך פקדי אלוטיפ מרובים אם נוגדנים של מקור חיה אחר או אלוטיפ משמשים.
4. הוסף 2-5 מיקרוגרם של נוגדן ספציפי, בהתאם לספציפיות של הנוגדן המשמש, או שליטת אלוטיפ לצינורות, בהתאמה.
5. לטלטל את הצינורות באמצעות nutator לילה ב 4 ° C כדי לאפשר היווצרות של קומפלקסי הכרומטין-נוגדנים.
6. הוסף 25 μl של חרוזים מגנטיים חלבון G (1:1 תרחיף של חרוזים מושעים) לתערובת לעיל ולאפשר לסלע לפחות 2 שעות ב 4 ° C. חרוזים מהספק שלנו יכולים לשמש באופן ישיר.
7. מניחים את צינורות microfuge על דוכן מגנטי ולאפשר את החרוזים לאסוף בצד ממוגנט.
8. להסיר את הפתרון בקפידה על ידי שאיפה מבלי להפריע את החרוזים.
9. הוסף 1 מ"ל של תמיסת מלח לשטוף נמוכה ומאפשר לטלטל בעדינות במשך 5 דקות על nutator. לאסוף את החרוזים באמצעות דוכן מגנטי והסר את הפתרון לשטוף. חזור פעם אחת.
10. הוסף 1 מ"ל של פתרון לשטוף מלח גבוה ולאפשר לסלע למשך 5 דקות על nutator. לאסוף את החרוזים באמצעות הדוכן המגנטי והסר את הפתרון לשטוף. חזור פעם אחת.
11. הוסף 1 מ"ל של פתרון לשטוף כלוריד ליתיום ולאפשר לסלע למשך 5 דקות על nutator. לאסוף את החרוזים באמצעות הדוכן המגנטי והסר את הפתרון לשטוף. חזור פעם אחת. השימוש בLiCl משפר הסרה היעילה של אינטראקציות הכרומטין שאינם ספציפיות עם החרוזים.
12. הוסף 1 מ"ל של תמיסת TE ולאפשר לסלע למשך 5 דקות על nutator. לאסוף את החרוזים באמצעות הדוכן המגנטי והסר את הפתרון לשטוף.
13. Elute את ה-DNA מן החרוזים ידי הוספת 250 μl של חיץ elution. סלע במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. פיפטה את eluate ולשמור חומר זה בצינור חדש 1.7 מיליליטר microfuge. חזור עוד פעם אחת, ולשלב גם את elutions. מחק את החרוזים.
14. כדי להפוך את הקישורים בין להוסיף 5 M NaCl לריכוז סופי של 0.3 M וμl 1 של RNase (20 מ ' גרם / מ"ל) ל-DNA eluted. הוסף μl 400 של חיץ elution לכניסות שנשמרו בשלב 3.2, על מנת להפוך את μl נפח 500. לכניסות להוסיף לNaCl 0.3 M, μl 1 של RNase, 10 μl של 0.5 M EDTA, 20 μl של 1 M טריס-HCl pH 6.5 וμl 1 של proteinase K (20 מ"ג / מ"ל).
15. דגירה צינורות הלילה בשעה 65 ° C בבלוק חימום יבש. כדי למנוע התאדות של דגימות, חותם או למקם משקל על הצינורות כדי למנוע מהם הפתיחה. יכול לשמש גם תנור הכלאה.
16. תן את הצינורות מגניבים RT. הוסף 100% אתנול 1 מ"ל ודגירה 2 HR-הלילה ב -80 ° C ל-DNA המשקע.
17. צנטריפוגה צינורות XG 16,000 במשך 15 דקות לגלולת ה-DNA. שטוף את כדור פעם אחת עם ה-DNA אתנול 70% ואוויר יבש גלולה. Resuspend גלולה DNA ב100 μl של מים מזוקקים autoclaved.
18. לטהר DNA באמצעות עמודות ספין QIAquick וelute בהיקף כולל של 50 μl של חיץ elution. ה-DNA הזה הוא מוכן לשימוש עבור ה-PCR.

"> 4. הכנת תגובת PCR (כל הצעדים חייבים להתבצע על קרח)

1. לאסוף את כל דגימות DNA מדגימות קלט שבב ומקבילות. כמו כן, לאסוף את כל חומרים כימיים PCR ופריימרים לאזור ממוקד, כמו גם אזור בקרה. השתמש DNA פולימרז "hotstart" תקי. אנו נשתמש בassay מבוסס ירוק SYBR לכמת הגברה DNA בהליך זה, אך ערכות mastermix qPCR ניתן להשתמש במידת צורך.
2. הפוך דילול סדרתי של ה-DNA הקלט כדי ליצור עקומה סטנדרטית בניתוח qPCR: למשל 10%, 1%, 0.1% ו 0.01% במאגר elution (מעמודות ספין QIAquick בשלב 3.18). טווח הריכוז והתוספת של סט תבנית עקומה סטנדרטי זה יכול להשתנות בהתאם לרמות הצפויות של העשרת שבב, וכו 'לוותר על 10 μl של דגימות DNA קלט בבארות בהתאמה של צלחת 96 היטב (Genemate, חתול # T-3182-1 ), בשני עותקים.
3. לוותר על ה-DNA 10 מיליליטר שבב משליטת אלוטיפ כמו גם נוגדן ספציפי בהתאמהבארות, בשלושה עותקים.
4. הפוך את "תערובת אמן" המכילה גם פריימרים היעד או primers בקרה (0.1 מיקרומטר ריכוז סופי של כל צבע יסוד) ולוותר על 10 μl לתוך בארות, בהתאמה. לדוגמה, בתבנית מתחת לוותר מיקס מאסטר המכיל פריימרים ממוקדים לתוך בארות מסומנות ירוק ולוותר תערובת אמן עם פריימרים בקרה לתוך בארות מסומנות אדום.
5. מכסה את צלחת PCR עם סרט איטום פלסטיק אופטי ו צנטריפוגות ב XG 500 בצנטריפוגה קלינית (~ 1,200 סל"ד) דקות 1 ב RT לאסוף את כל מה שבתחתית הבאר.
6. התחל תגובת PCR. אנו נשתמש בהפעלת 480 LightCycler השני (רוש) תוכנת LightCycler 480SW 1.5 לרוץ qPCR בדוגמה זו.

טרום דגירה: מחזור 1: 95 ° C דקות / 5.

הגברה: 40-45 מחזורים: 94 מעלות צלזיוס / 5 שניות, 60 ° C / 5 שניות, 72 ° C/10 שניות (חישול בטמפרטורה צריכה להיות 2-3 מעלות צלזיוס פחות מ temperatur ההיתוךדואר של primers).

עקומת התכה: מחזור 1.

קירור: מחזור 1.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

10% קלט

10% קלט

אלוטיפ

ספציפי

ב '

1% קלט

1% קלט

אלוטיפ

ספציפי

ג

קלט 0.1%

קלט 0.1%

אלוטיפ

ספציפי

D

0.01% קלט

0.01% קלט

E

10% קלט

10% קלט

אלוטיפ

ספציפי

F

1% קלט

1% קלט

אלוטיפ

ספציפי

סול

קלט 0.1%

קלט 0.1%

אלוטיפ

ספציפי

H

0.01% קלט

0.01% קלט

גרין: השתמש בפריימרים אזור מיקוד.

אדום: השתמש בפריימרים אזור שליטה.

5. אנליזה

1. תכנית תוכנת qPCR לכימות של כמות מוחלטת של ה-DNA. חשוב מכך, השימוש בעקומת סטנדרט לסכומים לשרבב DNA בדגימות הספציפיות והידועות אלוטיפ מאפשר הערכה וההתאמה של האיכות והיעילות של כל צבע היסוד שוקעת מעל הטווח של ריכוזים שנמצאו בדגימות. יתר על כן, הוא גם מספק מורדואר שיטה אמינה להמיר את CQ (C או C _{t P)} ערכים לתוצאות סופיות העשרה יחסית לקפל מאשר שיטות usingΔΔCq וקשורות.
2. לכו לעורך המדגם ולסמן את הבארות המכילות דגימות קלט של דילולים שונים (10%, 1%, 0.1% ו 0.01%) עם ערכי העקומה הסטנדרטיים שלהם. גם לתייג את הבארות עם דגימות שבב לא ידועות, בדיוק כפי שצלחת PCR ערוך. בתוכנה מקבילה בשימוש במכונות qPCR אחרים, לייעד תת מתאימים לתגובות לכל זוג פריימר, ערך ועקומה סטנדרטי מדגם שליטה ניסויית ואלוטיפ בהתאם.
3. בתוכנת LightCycler, ללכת לעורך משנה ולסמן את תת כולל כמו גם את הבארות עם דגימות קלט את דגימות השבב לא ידועות. את הדגימות ידועות תהיה לכמת באמצעות עקומת הסטנדרט שנוצרה מהריכוזים הידועים של דגימות קלט לניתוח. בתוכנה מקבילה בשימוש במכונות qPCR אחרים, לייעד תת corresponding לכל התגובות עבור כל צבע יסוד זוגות.
4. לאחר ההגברה PCR היא מוחלטת, לבצע את הניתוח עם "Quant/2nd מקס נגזר אבס" ובחר את משנה לניתוח ולחץ OK. בתוכנה מקבילה בשימוש במכונות qPCR אחרים, להמיר ערך CQ לכמות ה-DNA בכל קבוצת משנה.
5. לחץ על "חשב" שיפיק את עקומת הסטנדרט באמצעות הריכוזים הידועים של דגימות קלט ויציג את הכמות המוחלטת של הווה הדנ"א בדגימות לא ידועות.
6. אם האיכות של ה-DNA טעון היא טובה, ואם את פריימרים להיקשר באופן ספציפי לאזור ממוקד, יעיל PCR צריך להיות קרוב ל 2.
7. לבצע ניתוח עקום התכה עם "TM קורא" לאותה קבוצת המשנה, אם הוא זמין. שיא יחיד מצביע על כך שרק מוצר אחד מסוים היה מוגבר. הגברה של ה-DNA הספציפי גם יכולה להיבדק על ידי electrophoresing מוצר PCR יחד עם סולם הדנ"א דרך ג'ל agarose.
8. יצוא נתונים ככרטיסייה-קובץ טקסט מופרד, שניתן לפתוח ב-Microsoft Excel לניתוח נוסף.
9. השימוש ב-Microsoft Excel, לחלק את כמות ה-DNA לנוגדן הספציפי עם שליטת אלוטיפ לפריימרים ממוקדים. חזור על שלב זה עבור פריימרים אזור השליטה. אם נוגדנים מרובים של אותו אלוטיפ משמשים לimmunoprecipitations שונה, לנרמל את כל אלה עם הערכים מאותה שליטת אלוטיפ. יתר על כן, אם נעשו שימוש במספר רב של זוגות פריימר ממוקדים, כמויות DNA מסט זוג פריימר שליטה יחידה צריכים להיות בשימוש לנורמליזציה של כל יעד (איורים 1 ו -2). ערכי הפלט מייצגים את ההעשרה לקפל immunoprecipitation הנוגדן הספציפי בכל מיקום ביחס לimmunoprecipitation רקע הנוגדן שאינו ספציפי.
10. מחלקים את העשרת הקיפול (לאלוטיפ שליטה) לפריימרים ממוקדים עם העשרת הקיפול (לאלוטיפ שליטה) לפריימרים אזור שליטה כדי להשיג ביחס להעשרההאזור מאוגד שליטה (איור 1). חשוב לציין, לציין כי בגלל הדור של עקומות סטנדרטיות עם DNA קלט הכולל לכל מדגם, כל אחד מהערכים הנ"ל immunoprecipitation אינטרפולציה מהעקומות הסטנדרטיות כבר מנורמל, והביע כ, את החלק היחסי של תשומות כוללת על ידי תוכנת מחשב.
11. אם החומרה של המאגרים המשמשים לשטיפת immunoprecipitation או גבוהה מדי, זה אפשרי כי הגברה חזקה מדגימות immunoprecipitated עם נוגדנים ספציפיים יקויימו, תוך הגברה משליטת אלוטיפ immunoprecipitated דגימות לא נצפתה. בתרחיש כזה, עדיף להפחית את כמות שבב מלאה אלוטיפ משבב נוגדן ספציפי עבור שניהם באזור ממוקד והאזור מאוגד. העשרה היחסית יכולה להיות מחושבת על ידי חלוקת ההפרש לאזור מיקוד של הבדל עבור אזור מאוגד (איור 3).

תוצאות

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) פרוטוקול המובא כאן פקדים להבדלים, אם בכלל, בסך של ה-DNA משמש בPCR באמצעות שימוש בזוג פריימר שמגביר אזור מאוגד של הגנום, ובכך משמש כ" בקרת טעינה ". בדוגמא שמוצגת באיור 3, השתמשנו אזור הקידוד של גן Actb העכבר כמאוגד אזור לחלבון של עני...

Discussion

הפרוטוקול לעיל מספק שיטה חזקה של כימות מדויק העשרת DNA מלימפוציטים ראשוניים באמצעות שבב. אחת סיבות העיקריות לחוסנו בפרוטוקול זה היא ההכללה של משכפל ביולוגי. הפרוטוקול לעיל משתמש בשלוש חזרות, להעשרה אשר מחושבת באופן עצמאי. את היציאות לאחר מכן בממוצע כדי לספק מידה מ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Table of Equipment