כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

Summary

המאפיינים המכאניים של glycocalyx אנדותל נמדדו על ידי כניסה באמצעות כדורים בגודל מיקרון על cantilevers AFM. תאי אנדותל בתרבית בתא מותאם אישית תחת תנאי זרימה פיסיולוגיים לגרום ביטוי glycocalyx. נתונים נותחו באמצעות מודל סרט דק כדי לקבוע את העובי ומודולוס glycocalyx.

Abstract

ההבנה של האינטראקציה של לויקוציטים ודופן כלי הדם במהלך לכידת יקוציט מוגבל על ידי הבנה חלקית של התכונות המכאניות של שכבת פני השטח האנדותל. זה ידוע כי מולקולות דבקות על תאי דם לבנים מופצות לא אחידה ביחס למשטח ³ טופוגרפיה, הטופוגרפיה שמגבילה היווצרות קשרים עם דבק משטחים אחרים ^9, וכי כוחות המגע פיסיולוגיים (≈ 5.0-10.0 PN לmicrovillus) יכולים לדחוס את microvilli כל קטן כשליש מאורך המנוחה שלהם, להגדיל את הנגישות של מולקולות על פני השטח היריב ^{3, 7.} אנו רואים האנדותל כמבנה דו שכבתי, גוף התא הקשיח יחסית, בתוספת glycocalyx, ציפוי סוכר מגן רך על פני שטח luminal ^6. הוכח שglycocalyx יכול לפעול כמחסום להפחתת הידבקות של לויקוציטים לאנדותל ⁴ משטח.בדו"ח זה אנו מתחילים להתייחס deformability של משטחי אנדותל להבין כיצד הקשיחות המכאנית האנדותל עשויה להשפיע על היווצרות קשרים. תאי האנדותל הגדלים בתרבית סטטית אינם מבטאים glycocalyx חזק, אבל תאים שגודלו בתנאי זרימה פיסיולוגיות מתחילים המשוער glycocalyx נצפה בvivo ^2. מודולוס של גוף התא האנדותל כבר נמדד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) כדי להיות כ 5-20 kPa ^5. עובי המבנה של glycocalyx נחקרו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים ^8, ומודול של glycocalyx כבר מקורב תוך שימוש בשיטות עקיפות, אבל למיטב ידיעתנו, לא חל כל דו"חות רשמיים של מדידה ישירה של מודולוס glycocalyx בתאים חיים . במחקר זה, אנו מציגים ניסויים שנעשו עם הזחת רומן AFM בדיקה על תאים שכבר בתרבית בתנאים למקסם ביטוי glycocalyx למאמדידה ישירה של ke מודולוס והעובי של glycocalyx אנדותל.

Protocol

1. שיטות

לשכת תזרים סלולרי 1.1

תא זרימה, מוצג באיור 1, נבנה כך שניתן לגדל תאים תחת גזירה של 1.0 Pa (10 / סנטימטר dyn ²⁾ ולאחר מכן מועברים ישירות למקלט MFP3D AFM (סנטה ברברה, קליפורניה).

1. תא הזרימה היה מוכן לניסוי על ידי ניקוי תחילה את שקופיות הזכוכית בפתרון Piranha (03:01 H ₂ SO _4: H ₂ O ₂₎ במשך 15 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם במים מזוקקים. אז הם היו אופים ליבשים ומצופים בtriethoxy silane aminopropyl (APTES) בתא ואקום בתצהיר.
2. אטם סיליקון נחתך באמצעות כלי חיתוך SD צללית. זה אפשר לנו היטב לשלוט בממדים הקאמריים הזרימה לשליטה על קצב הזרימה ומאמץ גזירה בגדילת תאים. בדרך כלל, ערוץ נחתך 6.4 מ"מ רחב של 19 מ"מ ארוך מגיליון של סיליקון מ"מ 0.4. קצב הזרימה ההכרחי לסוגיםטה מאמץ גזירה של 1.0 Pa (10 dyn / סנטימטר ²⁾ מחושב בהנחה שהזרימה למינרית בערוץ מלבני עם המשוואה:

בי Q הוא קצב הזרימה, τ הוא מאמץ הגזירה, μ הוא הצמיגות הבינונית, מניח כאן להיות 1.0 MPA (0.01 dyn * שניות / סנטימטר ^2), h הוא הגובה והרוחב הוא הרוחב של תא הזרימה .

3. הקטע העליון של תא הזרימה היה מתואם עם האטם בצלחת תרבית תאים ומאובטחים עם טבעת מגנטית. ההרכבה הייתה מלאה באיזופרופיל אלכוהול (IPA) לעיקור.
4. מערכת הזרימה המלאה הורכבה. יציאות הזרימה בצלחת תרבית התאים הייתם מחוברות לשסתומים משולשים. השסתומים היו קשורים לפתיחת מזרק מ"ל 30s. IPA היה סמוק דרך המערכת, אז שנשטפה עם 30 מ"ל של מדיום של מקוי עם 4% עגל סרום עוברי (FCS). אז המערכת הייתה מלאה ב20 מ"ל של מדיום גידול תאי טכנולוגיות Vec. כיסויים הונחו על צמרות המזרקים. כובע מזרק המאגר לתפוס לו מחט במקום לזוז בינוני בחזרה למאגר ההזנה. 0.2 מסנני מיקרומטר סטריליים צורפו לפתחי כניסת האוויר בשמיכות כדי למנוע זיהום של המערכת. תא הזרימה היה אז מוכן לזריעת תאים.

תא תרבות 1.2

1. תאים אנושיים טבור וריד האנדותל (HUVEC של) ובינוני צמיחה נרכשו מטכנולוגיות Vec (Rensselaer, ניו יורק) וגדלו למפגש בT25 בקבוק.
2. מדיום הגידול הוסר מהבקבוקון וmonolayer של תאים משתחררים עם 2 מ"ל של טריפסין 2.5%. ברגע שהתאים היו בתמיסה, trypsinization היה רווה עם תוספת של 10 מ"ל של מדיום תרבות תא לבקבוק.
3. ההשעית תא דואר הייתה centrifuged למשך 5 דקות וsupernatant הוסר. התאים היו resuspended ב 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים (המכיל סרום) להזרקה לתוך תא הזרימה.
4. השעית התא (0.5 מ"ל, ~ 50,000 תאים) הוכנסה למזרק והזריקה לתוך תא הזרימה דרך שסתום שלוש דרך.
5. התאים הורשו להתיישב ולדבוק במצע הזכוכית ל2 שעות לפני הזרימה החלה. את התאים גודל תחת זרימה בחממה ב 37 ° C עבור 1 עד 5 ימים עד confluent.

הכנת Cantilever 1.3 וכניסה סלולרית

1. cantilevers AFM Tipless (NanoWorld, שוויץ) נוקו בחומצה חנקתית למשך 5 דקות ופונקציונליות עם triethoxy silane aminopropyl (APTES) בתא שיקוע.
2. פתרון של 5 מ"ג / מ"ל ​​לפי משקל NHS-sulfo-LC-ביוטין בתמיסת מלח Buffered של האנק (HBSS) היה מוכן. את cantilevers היה שקוע בפתרון במשך 15 דקות לconjuשער silane עם N-Hydroxysuccinimide כימיה (NHS).
3. פתרון של מדיום חופשי ביוטין נעשה על ידי דוגר 20 מ"ל של מדיום Vec טכנולוגיות תא התרבות (כולל סרום) עם 200 μl של חרוזי streptavadin עבור 12 שעות. החרוזים הוסרו מהמדיום עם מגנט והבינוני היה מסונן דרך מסנן סטרילי 0.22 מיקרומטר.
4. תא הזרימה הוסר מצלחת תרבית התאים והתאים נשטפו 37 ° C הבינוני ביוטין חינם.
5. פתרון מניות של μl 1 מתוך 2.4 מיקרומטר חרוזים מצופים בstreptavidin 1 מ"ל של מדיום חופשי ביוטין היה מוכן, ו100 μl של המניות נוספת לצלחת תרבית התאים.
6. חרוזי streptavidin נאספו בשלוחה על ידי נחיתת טיפ על משטח הזכוכית לצד, לחזור בו חרוז, מיצוב השיא של השלוחה מעל החרוז, ולאחר מכן לחיצה על השלוחה למטה, אל כמה שניות החרוזות ומנוחה.
7. הרגישות של השלוחה הייתה מידהד ידי indenting על אזור של זכוכית חשופה ובאמצעות השיפוע העקום להגדיר סטיית הקצה כפונקציה של מתח.
8. קבוע הקפיץ של השלוחה חושב אזי מכיול תרמי בתוכנת MFP3D.
9. השלוחה המכוילת שמשה אז לשנן את הדגימות, כפי שמוצגת באיור 2. 2.4 מיקרומטר חרוזים אלו מציעים שטח מגע גדול יותר עם תא השטח, כך שהתכונות המכאניות של שכבת glycocalyx הרכה ניתן לאתר. השלוחה הוצבה מעל תא ליד גרעין התא וגישה רכה של הקצה אל התא היה בשימוש כדי לקבוע את גובה השלוחה כ 3 מיקרומטר מעל פני שטח התא. התוכנה הוקמה במשך 20 חריצים חוזרים ונשנים בשיעור של 1 מיקרומטר / שנייה לכוח מקסימאלי של 7 NN. כ 6 שניות שחלפו בין אנשי קשר רצופים. ניתן להשתמש בתעריפים שונים של כניסה לבדיקת תכונות תלויות הזמן glycocalyx, אם כי באלה ראשוניים ניסויים, רק שיעור כניסה יחידה (מיקרומטר 1 / שני) היה בשימוש.

2. תאורית הזחה

כניסה למחצית שטח אלסטי עם מרחב של R רדיוס ניתן לתאר באמצעות תאורית הרץ שבו הכח של כניסה, F, נתונה על ידי המשוואה:

איפה δ הוא עומק ההזחה ו* E הוא מודולוס המופחת של החומר נבדק (איור 3). במקרה של indenter אינסוף נוקשה לפגוע חצי מרחב אלסטי אחיד, * דואר ניתן על ידי המשוואה:

3/50163eq3.jpg "/>
כאשר E היא מודולוס האלסטיות וν הוא יחס פואסון של החומר. העבודה האחרונה עם פולימר סרטים נתנה השראה לפיתוח מודל שתי שכבה לקביעת מודולוס והעובי של שכבות דקות ^1. אנו מיישמים את המודל הזה לביולוגיה של תא על ידי טיפול glycocalyx כסרט רך דק אחיד על פני השטח של גוף התא. שימוש במודל זה, מודולוס המופחת של המערכת הופך להיות:

כאשר E _GC הוא מודולוס של glycocalyx, _תא הדואר הוא מודולוס של גוף התא, P, Q ו n הם קבועים אשר נקבעו באופן אמפירי מהפולימר המתאים, וZ זה נתונה על ידי המשוואה:

-Together.within עמודים = "תמיד">
כאשר t הוא עובי שכבת glycocalyx. סכמטי של פרמטרים אלה מוצג באיור 3. המודל הוכח להיות דרך מדויקת של קביעת מודולוס והעובי של סרט דק על מצע ¹ נוקשה. משוואה זו יכולה לשמש כדי להתאים את העקומות המתקבלות מכניסה לתוך תאים כדי לקבוע מודולוס והעובי של glycocalyx האנדותל, כפי שמוצגת באיור 4.

תוצאות

בניסוי טיפוסי, 20 עקומות כוח לעומת מרחקים התקבלו מאזור נתון של התא, בדרך כלל באזור perinuclear, קרוב, אבל לא על, הגרעין (בתוך ~ 2 מיקרומטר). העקומות היו מיושרות לחשבון לכל סחף מדגם על משך הזמן של המדידה ולאחר מכן בממוצע להסרת רעש שלוחה, כפי שמוצגות באיור 4. העקומות נו...

Discussion

אנחנו השתמשנו ערכים מחושבים מהמודל דו שכבתי ותאורית הרץ למודל האינטראקציה של יקוציט במחזור הדם עם קיר אנדותל. אנו כי יש לחשב את microvillus על יקוציט בקוטר של 50 ננומטר בעומס 10 PN הייתי כניסה כ 150 ננומטר לglycocalyx, רק חלק קטן מהעובי הכולל. זה מצביע על כך glycocalyx, עם מאפיינים כפי שנמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / חומרים	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
הבינוני של מקוי	Gibco	16600-082
עוברי עגל בסרום	Hyclone	SH30070
בינוני צמיחת תאי אנדותל	טכנולוגיות Vec	MCDB-131
תאי אדם אספו טבורי וריד אנדותל	טכנולוגיות Vec	PHUVEC/T-25
חומצה גופרתית	JT בייקר	9681-02
מי חמצן	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl) triethoxysilane	אולדריץ	440140-100 מ"ל
איזופרופיל אלכוהול	VWR	BDH8999-4
טריפסין	Cellgro	25-054-C1
תמיסת מלח Buffered של האנק	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-ביוטין	Thermo Scientific	21335
חרוזי Streptavadin	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	מקלט מחקר
Cantilevers Tipless	Nanoworld	חץ TL1-50
הצללית SD	Quickutz	צללית-SD
גומי סיליקון	סטוקוול Elastomerics	SE50-RS
30 מיליליטר מזרקים	בנטון דיקינסון	309650
18 מחטי מד	בנטון דיקינסון	305196
סטים מאריכים	Hospira	4429-48
שסתומי 4 דרך	Teleflex	W21372
Caps נמלי זכר / נקבה	סמית של הרפואה	MX491B
משאבת peristaltic	ווטסון, מרלו	401U / D
אבובי peristaltic	ווטסון, מרלו	903.0016.016
מסננים סטריליים	מדעי חי Pall	4652