הכנה של חלבון רקומבינציה Mgm101 ידי אסטרטגיה תיוג מבוססת MBP

Summary

חלבון שמרי המיטוכונדריה nucleoid, Mgm101, הוא חלבון רקומבינציה Rad52 מסוג שיוצר טבעות oligomeric גדולות. פרוטוקול מתואר להכין Mgm101 רקומביננטי המסיס באמצעות חלבון מחייב מלטוז (MBP) תיוג אסטרטגיה בשילוב עם חילופי קטיון וכרומטוגרפיה הדרת גודל.

Abstract

גן MGM101 זוהה לפני 20 שנים לתפקידה בשמירה על ה-DNA של המיטוכונדריה. מחקרים ממספר קבוצות הראו כי חלבון Mgm101 מעורב בתיקון recombinational של ה-DNA המיטוכונדרי. חקירות שנעשו לאחרונה הצביעו על כך שMgm101 קשורה למשפחת חלבוני רקומבינציה Rad52 הסוג. חלבונים אלה יוצרים טבעות oligomeric גדולות ולקדם את חישול של מולקולות DNA גדילים הומולוגיים יחידה. עם זאת, האפיון של Mgm101 התעכב בשל הקושי בייצור חלבון רקומביננטי. כאן, הליך אמין להכנת רקומביננטי Mgm101 מתואר. חלבון המחייב מלטוז (MBP) מתויג Mgm101 בא לידי ביטוי הראשון בEscherichia coli. חלבון ההיתוך הוא מטוהרים בתחילה על ידי amylose זיקת כרומטוגרפיה. לאחר ששוחרר על ידי מחשוף פרוטאוליטי, Mgm101 מופרד מMBP ידי כרומטוגרפיה חילופי קטיוני. Monodispersed Mgm101 אז מתקבלעל ידי כרומטוגרפיה הדרת גודל. תשואה של 0.87 מ"ג של ~ Mgm101 לליטר תרבות חיידקים יכולה להיות שהושגה באופן שגרתי. יש Mgm101 רקומביננטי זיהום מינימאלי של ה-DNA. הדגימות המוכנות משמשות בהצלחה לניתוחי תמונת חלקיקים ביוכימיים, מבניים ואחת של Mgm101. פרוטוקול זה יכול לשמש גם להכנת חלבונים שעשויים להיות misfolded ורעיל לתאי חיידקי ה-DNA מחייב oligomeric גדולים אחרים.

Introduction

הומולוגי רקומבינציה היא חשובה לתיקון של הפסקות פעמי גדיל (DSBs) וinterstrand crosslinks, ולreinitiation של שכפול הדנ"א ממזלגות שכפול התמוטטו ^1. בקונבנציונלי הומולוגית רקומבינציה, התגובה המרכזית היא catalyzed ידי recombinases ATP התלויים בי RecA בפרוקריוטים, וRAD51 וDmc1 אאוקריוטים ^1-3. recombinases אלה יוצרים סיבי nucleoprotein על ssDNA, שהם חיוניים לייזום חיפוש הומולוגיה ופלישה גדיל DNA בתוך תבניות דופלקס (איור 1, פנל משמאל) ^4-7. בנוסף לערכה הרגילה, הומולוגית רקומבינציה יכולה להתבצע גם באופן RecA/Rad51-independent (איור 1, פנל מימין). לדוגמה, את Rad52 וRad59 חלבוני שמרים ישירות יכולים לזרז חישול של גדילי ssDNA משלימים אשר נחשפו על ידי resectioning הפסקות dsDNA. תהליך רקומבינציה זה, המכונה לשירגדיל le חישול, בדרך כלל אינו כרוך הומולוגי זיווג עם תבניות dsDNA. לאחר חישול, זנבות Heterologous יוסרו על ידי exonucleases וניקס היא ligated לשחזר ^8-10 המשכיות הגנום. תיקון על ידי מנגנון חישול הגדיל הבודד מלווה לעתים קרובות על ידי מחיקות של רצפים גנטיים בין אזורים ישירות חוזרים ונשנים.

Rad52 שייך לקבוצה מגוונת של חלבוני רקומבינציה כי הם נפוצים בקרב bacteriophages ^11. חלבונים אלו ידועים גם כחישול חלבונים גדיל בודד (SSAPs), המבוססים על פעילותם בקידום חישול של מולקולות DNA גדילים הומולוגיים יחידה. את SSAPs bacteriophage אפיין הטוב ביותר הם Redβ וERF מbacteriophages λ וP22, RECT מRAC prophage וחלבון סאק מהפאג lactococcal ul36. את SSAPs מאופיין מבני על ידי קיפול β-β-β-α טיפוסי, אם כי דמיון הוא כמעט undetectתוכל ברצפים העיקריים שלהם. הם כל צורת הטבעות גדולות הומו-oligomeric של 10 - פי הסימטריה 14 במבחנה ^12-14. ההשלכות התפקודיות של ארגון זה אופייני גבוה סדר מבני אינה מובנות היטב.

אנחנו מעוניינים בהבנת המנגנון של רקומבינציה הומולוגית בגנום המיטוכונדריה. אנחנו זיהינו בעבר את גן MGM101 כי הוא חיוני לשמירה על mtDNA בSaccharomyces cerevisiae ^15. MGM101 מכן היה נמצא קשור עם nucleoids המיטוכונדריה והוא נדרש לסובלנות של mtDNA לסוכני ה-DNA נזק ^16. עם זאת, המחקר של Mgm101 כבר התאפק בעשור האחרון על ידי הקושי לייצר Mgm101 רקומביננטי. הצלחנו לאחרונה בהפקת Mgm101 המסיס בכמויות גדולות מא coli באמצעות אסטרטגית MBP-Fusion. זה אפשר לנו להוכיח כי Mgm101 מניותדמיון מבני וביוכימיים עם Rad52 למשפחה של חלבוני ^17,18. בדו"ח זה, הליך טיהור שלושה שלבים מתואר, המייצר ניתוחים ביוכימיים ומבניים Mgm101for הומוגניות (איור 2).

Protocol

מחקרים קודמים הראו כי 22 שאריות אמינו המסוף הראשונות של Mgm101 הם ביקע לאחר יבוא לתוך המיטוכונדריה ^19. לביטוי בEscherichia coli, מסגרת הקריאה הפתוחה MGM101 חסרת 22 קודונים הראשונים מוגברת על ידי PCR והניחה במורד הזרם של רצף זכר המקודד את החלבון מחייב מלטוז (MBP) בגרסה שונה של וקטור ביטוי pMAL-c2E. זה יוצר היתוך MBP-Mgm101 עם מקשר המכיל אתר מחשוף לפרוטאז PreScission (איור 3). פלסמיד נבנה ראשון על ידי בחירת א ' transformants coli ללא IPTG והבחירה כחולה / לבן Xgal. PMAL-c2E-MGM101 פלסמיד שנוצר לאחר מכן הוכנס E. coli להתאמץ BL21-CodonPlus (DE3)-RIL על ידי בחירת אמפיצילין ומושבות עמידות chloramphenicol.

1. ביטוי, אינדוקציה, תמוגה תא וטיפול אני DNase

1. חנ"לulate transformants טרי ב 10 מ"ל של מדיום LB (1% Bacto tryptone, 0.5% תמצית שמרים, 1% NaCl) בתוספת סוכר (0.2%), אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל) וchloramphenicol (50 מיקרוגרם / מ"ל). לדגור על 37 מעלות CO / N עם הרעד ב 200 סל"ד.
2. לחסן preculture מיליליטר 10 ל 2 ליטרים של מדיום LB בתוספת כאמור לעיל. לגדל את התאים ב 37 ° C עם הרעד עד שמגיע OD ₆₀₀ 0.5.
3. לגרום לביטוי של חלבון היתוך MBP-Mgm101 ידי הוספת β-D-1-thiogalactopyranoside איזופרופיל (IPTG) בריכוז סופי של 0.3 מ"מ. לגדל את התאים עם הרעד על 30 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות.
4. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה באמצעות קמן הרוטור JA-10 (5500 XG, 4 ° C, 10 דקות). לאחר השלכת supernatant, resuspend התא גלולה ב 30 מ"ל של חיץ תמוגה (20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4 ו1 mM EDTA, pH 7.4) המכיל מעכבי פרוטאז (25 מיקרומטר leupeptin, pepstatin 1 מיקרומטר והמ"מ PMSF 1).
5. Sonicate השעיה תא על קרח למשך 20שניות באמצעות מעבד קולי (חום מערכות; דגם W-385) ב -50% מחזור, להתקרר על קרח למשך 30 שניות, וחזור 2x.
6. הוסף 1 מ"ל של מניית 1 DNAse ב2 מ"ג / מ"ל. Rock lysate התא על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 2.
7. התאם NaCl לריכוז סופי של 500 מ"מ.
8. הסר את פסולת התא על ידי צנטריפוגה ב10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

2. טיהור עם amylose זיקת כרומטוגרפיה

1. לאזן 1.5 מ"ל של שרף amylose (50% תרחיף) במאגר תמוגה. הוסף את שרף amylose equilibrated לlysate התא. לטלטל בעדינות על 4 מעלות CO / נ
2. טען את תמהיל lysate השרף על עמודת כרומטוגרפיה Econo-טור המותקנת בחדר קר. לאפשר את החלבונים מאוגד כדי להעביר את העמודה על ידי כוח הכבידה.
3. שטוף את שרף amylose עם 300 מ"ל של החיץ לשוטפי (20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 400 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4, ו -0.2 מ"מ PMSF).
4. חזור על לשטוף עם 150 מ"ל של חיץ לשטוף השני (20 מ"מ TRIS-HCl, pH 7.4, 200 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4, ו -0.2 מ"מ PMSF).
5. הוסף 5 מ"ל של חיץ elution (20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 200 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4, ו -0.2 מ"מ PMSF, 10 מ"מ מלטוז) לעמודה, דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לאסוף eluate וחזור על הפעולה פעמים נוספות.
6. שלב את eluates, לקבוע את התשואה וטוהר של MBP-Mgm101 על ידי טעינת aliquot של eluate על ג'ל SDS-PAGE אחריו מכתים Coomassie (איור 4).

3. מחשוף פרוטאז PreScission וכרומטוגרפיה Exchange קטיון

1. הוסף 50 יחידות של פרוטאז PreScission לeluate MBP-Mgm101. לבצע את המחשוף על 4 מעלות CO / N ולאפשר לו להמשיך בדיאליזה נגד חיץ הדיאליזה (20 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 100 מ"מ NaCl, 2 מ"מ DTT, 1 mM EDTA, pH 7.4, ו -0.2 מ"מ PMSF)
2. בדקו את היעילות של מחשוף על ג'ל SDS-PAGE (איור 5 א).
3. טען MBP-Mgm101 ביקע על ידי מספר רב של להזריקיונים על מחסנית מיני מקרו Prep S גבוה ביו סולם מחוברים למערכת FPLC DuoFlow ביולוגית ביו רד.
4. התחל כרומטוגרפיה חילופי קטיון על ידי יישום הדרגתי צעד מלח של 5 מ"מ, 300 מ"מ, 500 מ"מ, 750 מ"מ ו -1000 מ"מ של NaCl, אשר נוצר על ידי הצפת ערבוב (5 מ"מ NaCl, 10 מ"מ Na-פוספט, pH 7.2, 1 מ"מ PMSF) והצפה ב '(1 M NaCl, 10 מ"מ Na-פוספט, pH 7.2, 1 מ"מ PMSF). הגדר את קצב הזרימה של 0.5 מ"ל / דקה. לאסוף את שבר Mgm101 ולבדוק את הטוהר של החלבון בג'ל-SDS (איור 5).

4. גודל הרחקת כרומטוגרפיה

1. מערבבים את שברי החלבון מכרומטוגרפיה חילופי קטיון. Dialyze החלבון במאגר איזון GF (20 מגבים מ"מ, pH 7.0, 150 מ"מ NaCl, 1 המ"מ EDTA, pH 7.4, 5 מ"מ 2-mercaptoethanol; 0.2 מ"מ PMSF).
2. לרכז את החלבון עם טור ספין Ultrafiltration 15R Vivaspin כדי להפחית את עוצמת קול ל~ 1 מ"ל על ידי מסתובב ב -3,000 XG ב 4 ° C.
3. טען Mgm101 Oנה מכוילת Superose עמודת כיתה 6 הכנה equilibrated עם חיץ כרומטוגרפיה (20 מגבים מ"מ, pH 7.0, 150 מ"מ NaCl, 5 מ"מ β-mercaptoethanol; 1 mM EDTA, pH 7.4, 0.2 מ"מ PMSF).
4. התחל עם הדרת גודל מאגר כרומטוגרפיה לרוץ בקצב זרימה של 0.5 מ"ל / דקה.
5. לאסוף את השברים של את Mgm101 הפסגות מטוהרות. טען aliquots של שברים על 12%-SDS לבדיקת האיכות הסופית של החלבון.
6. לרכז את החלבון עם 6 Vivaspin, ואז להקפיא במהירות את הדגימות בN2 נוזל חנות ב -80 ° C.
7. השתמש בדגימות Mgm101 בתוך 6-12 חודשים עבור assay ssDNA מחייב (איור 8) ולהדמיה מבנית על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (איור 9).

תוצאות

Mgm101 הוא חלבון הקשור לרקומבינציה Rad52 במיטוכונדריה. Rad52 נחקר בהרחבה על תפקידה ברקומבינציה הדנ"א המיטוכונדרי (איור 1). רקומביננטי Mgm101 יכול להיות מוכן על ידי הליך בן שלושת שלבים (איור 2). זה הקל על ידי השימוש באסטרטגית MBP התיוג המאפשרת Mgm101 לבוא לידי ביטו?...

Discussion

זה כבר אתגר לייצר, Mgm101 חלבון רקומביננטי יליד יציב מא coli אולי בשל insolubility בתאי חיידקים. בדו"ח זה, אנו מציגים את אסטרטגית MBP-המאפשרת היתוך החלבון לבוא לידי ביטוי ברמה גבוהה למדי. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים שליליים מכתים וכרומטוגרפיה הדרת גודל, יש לנו הרא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expression vector pMAL-c2E	New England Biolabs	#N8066S
PreScission Protease	GE Healthcare Life Sciences	#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells	Strategene	#230245
Leupeptin	Roche Applied Science	#11034626001
Pepstatin	Roche Applied Science	#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Roche Applied Science	#10837091001
DNAse I	Sigma	#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Roche Applied Science	#11411446001
Amylose resin	New England Biolabs	#E8021L
Econo-Column chromatography column	BIO-RAD	#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)	BIO-RAD	#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS15RH02
Superose 6 prep grade column	Amersham Bioscirnces	#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS0611