Preparação do Mgm101 recombinação de proteínas por Estratégia Tagging baseado MBP

Resumo

A proteína de levedura nucleóide mitocondrial, Mgm101, é uma proteína de recombinação de tipo rad52 que forma anéis grandes oligoméricas. Um protocolo é descrito para preparar Mgm101 solúvel recombinante utilizando a proteína de ligação à maltose (MBP), acoplado com a estratégia de marcação de permuta catiónica e a cromatografia de exclusão de tamanho.

Resumo

O gene foi identificado MGM101 há 20 anos pelo seu papel na manutenção do DNA mitocondrial. Estudos realizados em vários grupos têm sugerido que a proteína Mgm101 está envolvida na reparação de recombinação do DNA mitocondrial. Investigações recentes têm indicado que Mgm101 está relacionado com a família de proteínas do tipo de recombinação de RAD52. Estas proteínas formam anéis grandes oligómeros e promover a hibridação de moléculas de homólogo de ADN de cadeia simples. No entanto, a caracterização das Mgm101 tem sido dificultada pela dificuldade em produzir a proteína recombinante. Aqui, um processo de confiança para a preparação de proteínas recombinantes é descrita Mgm101. Maltose Binding Protein (MBP), marcado Mgm101 é expressa pela primeira vez em Escherichia coli. A proteína de fusão é inicialmente purificado por cromatografia de afinidade em amilose. Depois de ser libertado por clivagem proteolítica, Mgm101 é separada por cromatografia de troca PAM catiónica. Monodispersas Mgm101 é então obtidopor cromatografia de exclusão de tamanho. Um rendimento de ~ 0,87 mg de Mgm101 por litro de cultura bacteriana pode ser rotineiramente obtidos. O Mgm101 recombinante tem o mínimo de contaminação de ADN. As amostras preparadas são utilizadas com sucesso para a análise da imagem de partículas bioquímicos, estruturais e de Mgm101 único. Este protocolo pode igualmente ser utilizado para a preparação de outros grandes proteínas de ligação de ADN oligoméricas que podem ser deformadas e tóxico para as células bacterianas.

Introdução

A recombinação homóloga é importante para a reparação de quebras de cadeia dupla (DSB) e reticulações intercadeias, e para a re-introdução de garfos de replicação de ADN de replicação colapsadas ^1. Na recombinação homóloga convencional, a reacção é catalisada pela central, as recombinases dependentes de ATP, incluindo RecA em procariotas, e Rad51 e Dmc1 em eucariotas ^1-3. Estas recombinases formar filamentos nucleoprotéicos em ADNcs, que são essenciais para iniciar a pesquisa de homologia e invasão vertente dúplex dentro de moldes de ADN (Figura 1, painel da esquerda) ^4-7. Além do esquema convencional, a recombinação homóloga pode também ocorrer de uma forma RecA/Rad51-independent (Figura 1, painel da direita). Por exemplo, a levedura RAD52 e Rad59 proteínas podem catalisar directamente o recozimento de cordões ssDNA complementares que são expostos por ressecção de dsDNA quebras. Este processo de recombinação, conhecido como cantarle vertente recozimento, geralmente não envolve o emparelhamento homólogo com modelos dsDNA. Após o recozimento, caudas heterólogos são removidos por exonucleases e entalhes são ligados para restaurar a continuidade do genoma ^8-10. Reparação pelo único mecanismo de recozimento vertente é muitas vezes acompanhada de exclusões de seqüências genômicas entre as regiões diretamente repetidas.

Rad52 pertence a um grupo diverso de proteínas de recombinação que são comuns entre os bacteriófagos ^11. Estas proteínas são também conhecidos como fio único Proteínas de recozimento (SSAPs), com base na sua actividade na promoção da hibridação de moléculas de homólogo de ADN de cadeia simples. Os melhores SSAPs bacteriófagos são caracterizadas e redp Erf do bacteriófagos λ e P22, RecT do profago rac Sak e a proteína do fago Lactococcus ul36. Os SSAPs são estruturalmente caracterizados por uma dobra β-β-β-α típico, apesar de similaridade é virtualmente indetectávelpoder em suas seqüências primárias. Todos eles formam grandes anéis de homo-oligoméricas de 10-14 simetria vezes in vitro ^12-14. As implicações funcionais desta organização estrutural de ordem superior característica não é bem compreendida.

Estamos interessados ​​em compreender o mecanismo de recombinação homóloga no genoma mitocondrial. Foram identificadas anteriormente MGM101 o gene que é essencial para a manutenção de mtDNA em Saccharomyces cerevisiae ^15. MGM101 foi posteriormente se verificou estar associada com nucleoids mitocondriais e é necessário para a tolerância de mtDNA com agentes prejudiciais de ADN ^16. No entanto, o estudo da Mgm101 foi retido na última década pela dificuldade de produzir Mgm101 recombinante. Recentemente, conseguiu produzir Mgm101 solúvel em grandes quantidades a partir de E. coli utilizando a estratégia de fusão MBP. Isso nos permitiu demonstrar que Mgm101 açõessemelhanças bioquímicas e estruturais com o rad52-família de proteínas ^17,18. Neste relatório, um procedimento de purificação de três passos é descrito, que produz Mgm101for análises bioquímicas e estruturais homogéneos (Figura 2).

Protocolo

Estudos anteriores têm mostrado que os primeiros 22 amino-terminais de resíduos de Mgm101 são clivados após a importação para mitocôndrias ^19. Para expressão em Escherichia coli, a grelha de leitura aberta MGM101 faltam os primeiros 22 codões é amplificado por PCR e colocados a jusante da sequência malE que codifica a proteína de ligação à maltose (MBP) com uma versão modificada do vector de expressão pMAL-C2E. Isto gera a fusão MBP-Mgm101 com um ligante contendo um local de clivagem para a protease PreScission (Figura 3). O plasmídeo foi construído pela primeira vez através da selecção E. transformantes coli sem IPTG e seleção azul / branco Xgal. O plasmídeo resultante pMAL-C2E-MGM101 é então introduzido na E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL seleccionando ampicilina e colônias resistentes cloranfenicol.

1. Expressão, indução, Lise celular e DNase I Tratamento

1. Inocular transformantes fresco em 10 ml de meio LB (1% de Bacto-triptona, extracto de levedura 0,5%, NaCl a 1%) suplementado com glucose (0,2%), ampicilina (100 ug / ml) e cloranfenicol (50 mg / ml). Incubar a 37 ° CO / N com agitação a 200 rpm.
2. Inocular os 10 ml de pré-cultura em 2 litros de meio LB suplementado como acima. Crescer as células a 37 ° C com agitação até _DO600 atinge 0,5.
3. Induzir a expressão da proteína de fusão MBP-Mgm101 adicionando isopropílico β-1-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a uma concentração final de 0,3 mM. Crescer as células com agitação a 30 ° C durante 5 horas.
4. Recolher as células por centrifugação utilizando uma Beckman JA-10 do rotor (5500 xg, a 4 ° C, 10 min). Depois de deitar fora o sobrenadante, ressuspender o sedimento celular em 30 ml de tampão de lise (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 e EDTA 1 mM, pH 7,4) contendo inibidores de proteases (leupeptina a 25 uM, 1 uM de pepstatina A e PMSF 1 mM).
5. Sonicate suspensão de células em gelo por 20seg utilizando um processador ultra-sónico (Sistemas de Calor, Modelo W-385) a 50% do ciclo, deixa-se arrefecer em gelo durante 30 segundos, e repetir 2x.
6. Adicionar 1 ml de DNAse um estoque de 2 mg / ml. Balance o ligado celular a 4 ° C durante 2 horas.
7. Ajuste de NaCl a uma concentração final de 500 mM.
8. Remover os detritos celulares por centrifugação a 10.000 xg, a 4 ° C durante 30 min.

2. Purificação com amilose Affinity Chromatography

1. Equilibrar 1,5 ml de resina de amilose (50% de pasta) no tampão de lise. Adicionar a resina de amilose equilibrada ao lisado celular. Balançar suavemente a 4 ° CO / N.
2. Coloque a mistura lisado-resina sobre uma coluna de cromatografia de coluna Econo-instalado em uma sala fria. Permitir que as proteínas não ligadas a passar da coluna por gravidade.
3. Lava-se a resina de amilose com 300 ml de tampão de lavagem I (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 400 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 e PMSF 0,2 mM).
4. Repetir a lavagem com 150 ml de tampão de lavagem II (T 20 mMris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 e PMSF 0,2 mM).
5. Adicionam-se 5 ml de tampão de eluição (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, pH 7,4 e PMSF 0,2 mM, maltose a 10 mM), para a coluna, incubar a 4 ° C durante 10 minutos, recolher eluato e repita para mais vezes.
6. Combina-se os eluatos, determinar o rendimento e a pureza da MBP-Mgm101 por carregamento de uma aliquota de eluato num gel de SDS-PAGE seguido por coloração com Coomassie (Figura 4).

3. PreScission Cleavage Protease e cromatografia de troca catiônica

1. Adicionar 50 unidades de protease PreScission ao eluato MBP-Mgm101. Realizar a clivagem, a 4 ° CO / N e permitir que ele continue durante a diálise contra o tampão de diálise (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4; NaCl 100 mM; DTT 2 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4 e PMSF 0,2 mM)
2. Verificar a eficiência da clivagem num gel de SDS-PAGE (Figura 5A).
3. Carregue o clivada MBP-Mgm101 por vários injetariões sobre um cartucho Mini Macro-Prep S alta Bio-Scale ligada a um sistema FPLC de fluxo duplo biológica da Bio-Rad.
4. Iniciar a cromatografia de permuta catiónica por aplicação de um gradiente por passos de sal de 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM e 1000 mM de NaCl que é criado através da mistura de tampão (NaCl a 5 mM, 10 mM Na-fosfato, pH 7,2, 1 PMSF mM) e tampão B (NaCl 1 M, 10 mM Na-fosfato, pH 7,2, 1 mM de PMSF). Ajuste a velocidade de fluxo de 0,5 ml / min. Recolher a fracção Mgm101 e verificar a pureza da proteína num gel de SDS-PAGE (Figura 5B).

4. Cromatografia de Exclusão por Tamanho

1. Combine as frações protéicas de cromatografia de troca catiônica. Dializar a proteína em tampão de equilíbrio GF (MOPS 20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, 5 mM de 2-mercaptoetanol, PMSF 0,2 mM).
2. Concentra-se a proteína com VIVASPIN coluna de spin 15R ultrafiltração para reduzir o volume de ~ 1 ml por centrifugação a 3000 xg, a 4 ° C.
3. Coloque o Mgm101nd calibrado coluna de Superose 6 de grau prep equilibrada com o tampão de cromatografia (20 mM de MOPS, pH 7,0, NaCl 150 mM, 5 mM de mercaptoetanol; β-EDTA 1 mM, pH 7,4, PMSF 0,2 mM).
4. Iniciar a exclusão de tamanho com o tampão de cromatografia correr a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min.
5. Recolha as frações dos purificados Mgm101 picos. Carregar alíquotas das fracções em 12% SDS-PAGE para verificar a qualidade final da proteína.
6. Concentra-se a proteína com VIVASPIN 6, em seguida, congelar rapidamente as amostras em N2 líquido e armazenam-se a -80 ° C.
7. Use as Mgm101 amostras dentro de 6-12 meses para o ensaio de ligação de ADNcs (Figura 8) e para visualização estrutural por microscopia electrónica de transmissão (Figura 9).

Resultados

Mgm101 é uma proteína de recombinação RAD52 relacionada nas mitocôndrias. RAD52 tem sido extensivamente estudada pelo seu papel na recombinação do ADN mitocondrial (Figura 1). Mgm101 recombinante podem ser preparados por um procedimento em três passos (Figura 2). Isto é facilitado pela utilização da estratégia de MBP-marcação permite que Mgm101 a ser expresso numa forma solúvel e subsequentemente libertado a partir da etiqueta por clivagem proteolitica (Figura 3)....

Discussão

Foi um desafio para a produção de um estábulo, nativo da proteína recombinante a partir de E. Mgm101 coli, possivelmente devido à sua insolubilidade em células bacterianas. Neste relatório, que mostram que a estratégia de fusão MBP-permite que a proteína seja expressa com um nível razoavelmente elevado. Por meio da coloração de microscopia electrónica de transmissão negativo e cromatografia de exclusão de tamanho, mostrámos previamente que a proteína de fusão MBP-forma oligómeros un...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expression vector pMAL-c2E	New England Biolabs	#N8066S
PreScission Protease	GE Healthcare Life Sciences	#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells	Strategene	#230245
Leupeptin	Roche Applied Science	#11034626001
Pepstatin	Roche Applied Science	#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Roche Applied Science	#10837091001
DNAse I	Sigma	#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Roche Applied Science	#11411446001
Amylose resin	New England Biolabs	#E8021L
Econo-Column chromatography column	BIO-RAD	#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)	BIO-RAD	#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS15RH02
Superose 6 prep grade column	Amersham Bioscirnces	#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS0611