Vorbereitung des Mgm101 Rekombinationsprotein von MBP-based Tagging-Strategie

Zusammenfassung

Die Hefe-Mitochondrien nucleoid Protein, Mgm101, ist ein Rad52-Typ Rekombinationsprotein die große oligomere Ringe bildet. Ein Protokoll wird beschrieben, dass lösliches rekombinantes Mgm101 vorzubereiten mit dem Maltose Binding Protein (MBP)-Tagging-Strategie mit Kationenaustausch und Größenausschlusschromatographie gekoppelt.

Zusammenfassung

Die MGM101 Gen wurde vor 20 Jahren für seine Rolle bei der Aufrechterhaltung der mitochondrialen DNA identifiziert. Studien aus mehreren Gruppen haben vorgeschlagen, dass das Protein in der Mgm101 recombinational Reparatur der mitochondrialen DNA beteiligt ist. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass Mgm101 der Rad52-Typ Rekombinationsprotein Familie verwandt ist. Diese Proteine ​​bilden große oligomere Ringe und fördern die Anlagerung homologen einzelne DNA-Moleküle. Allerdings hat die Charakterisierung von Mgm101 der Schwierigkeit bei der Herstellung des rekombinanten Proteins behindert. Hier wird ein zuverlässiges Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Mgm101 beschrieben. Maltose Binding Protein (MBP)-markierten Mgm101 zunächst in Escherichia coli exprimiert. Das Fusionsprotein wird zunächst durch Amylose-Affinitätschromatographie gereinigt. Nach der Begrüßung durch proteolytische Spaltung freigesetzt wird Mgm101 von MBP durch Kationenaustauschchromatographieschritt getrennt. Monodispersen Mgm101 erhält danndurch Größenausschlusschromatographie. Eine Ausbeute von ~ 0,87 mg Mgm101 pro Liter Bakterienkultur kann routinemäßig erhalten. Das rekombinante Mgm101 eine minimale Verunreinigung der DNA. Die vorbereiteten Proben werden erfolgreich für biochemische, strukturelle und Single Particle-Image-Analysen von Mgm101 verwendet. Dieses Protokoll kann auch zur Herstellung von anderen großen oligomere DNA-bindende Proteine ​​falsch gefaltet und giftig für Bakterienzellen verwendet werden.

Einleitung

Homologe Rekombination ist für die Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB) und Interstrang Vernetzungen und für die Wiederaufnahme der DNA-Replikation von eingestürzten Replikationsgabeln ¹ wichtig. In konventionellen homologen Rekombination ist die zentrale Reaktion der ATP-abhängigen Rekombinasen wie RecA in Prokaryoten und Rad51 und Dmc1 in Eukaryonten ^1-3 katalysiert wird. Diese Rekombinase bilden nucleoprotein Filamente auf ssDNA, die unerlässlich für die Einleitung Homologiesuche und Stranginvasion innerhalb duplex DNA-Templates (Abbildung 1, links) ^4-7 sind. Zusätzlich zu den herkömmlichen Schema kann homologe Rekombination auch in einer Weise RecA/Rad51-independent (Abbildung 1, rechts). Zum Beispiel kann die Hefe Rad52 und Rad59 Proteine ​​direkt katalysieren die Anlagerung komplementäre ssDNA-Stränge, die durch Resektion von dsDNA Unterbrechungen ausgesetzt sind. Diese Rekombination Prozess, da singen bekanntle Banddurchlaufanlagen, hat in der Regel nicht um homologe Paarung mit dsDNA Vorlagen. Nach dem Glühen werden heterologe Schwänze durch Exonucleasen entfernt und Kerben sind ligiert Genom Kontinuität ^8-10 wiederherzustellen. Reparatur durch den einzigen Banddurchlaufanlagen Mechanismus wird oft durch Deletionen von genomischen Sequenzen zwischen direkt wiederholt Regionen begleitet.

Rad52 gehört zu einer vielfältigen Gruppe von Proteinen, die Rekombination verbreitet unter ¹¹ Bakteriophagen sind. Diese Proteine ​​sind auch als Single Strand Annealing Proteine ​​(SSAPs) bekannt, auf der Grundlage ihrer Aktivität in der Förderung der Anlagerung homologen einzelsträngige DNA-Moleküle. Die am besten charakterisierten Bakteriophagen SSAPs sind Redβ und Erf vom Bakteriophagen λ und P22, RecT vom Prophagen rac und der Sak-Protein aus der Lactococcus-Phagen UL36. Die SSAPs sind strukturell durch eine typische β-β-β-α fach dadurch, obwohl Ähnlichkeit praktisch Nichterfassungssignal wirdkönnen in ihrer primären Sequenzen. Sie alle bilden große homooligomeren Ringe von 10 - 14 fache Symmetrie in vitro ^12-14. Die funktionellen Auswirkungen dieser Eigenschaft höherer Ordnung strukturelle Organisation ist nicht gut verstanden.

Wir sind daran interessiert, zu verstehen, den Mechanismus der homologen Rekombination in der mitochondrialen Genoms. Wir haben zuvor die MGM101 Gen, das für die Aufrechterhaltung der mtDNA in Saccharomyces cerevisiae ¹⁵ identifiziert. MGM101 anschließend wurde festgestellt, dass mitochondriale Nukleoide an und ist für die Toleranz der mtDNA auf DNA-schädigende Mittel ¹⁶ erforderlich. Allerdings wurde in der Studie von Mgm101 wurde zurück in den letzten zehn Jahren durch die Schwierigkeit gehalten rekombinanten Mgm101 erzeugen. Wir haben vor kurzem in der Herstellung von löslichen Mgm101 bei großen Mengen aus E. gelungen coli mit dem MBP-Fusion-Strategie. Dies hat es uns ermöglicht, dass Mgm101 Aktien demonstrierenbiochemische und strukturelle Ähnlichkeiten mit dem Rad52-Familie von Proteinen ^17,18. In diesem Bericht wird eine dreistufige Reinigungsverfahren beschrieben, die produziert homogene Mgm101for biochemische und strukturelle Analysen (Abbildung 2).

Protokoll

Frühere Studien haben gezeigt, dass die ersten 22 aminoterminalen Reste von Mgm101 nach dem Import in Mitochondrien ¹⁹ gespalten werden. Zur Expression in Escherichia coli, wird das MGM101 offenen Leserahmen ohne die ersten 22 Codons durch PCR amplifiziert und hinter die männlichen Sequenz, die das Maltose-bindende Protein (MBP) in einer modifizierten Version des Expressionsvektors pMAL-C2E platziert. Dies erzeugt die MBP-Mgm101 Fusion mit einem Linker, der eine Spaltstelle für die Protease PreScission (Abbildung 3). Das Plasmid wird zunächst durch Auswahl E. konstruiert coli Transformanten ohne IPTG und X-Gal blau / weiß-Selektion. Das resultierende Plasmid pMAL-C2E-MGM101 wird dann in den E. eingeführt coli-Stamm BL21-CodonPlus (DE3)-RIL indem Sie Ampicillin und Chloramphenicol-resistenten Kolonien.

1. Expression, Induktion, Cell Lysis und DNase I Behandlung

1. InocUlate frisch Transformanten in 10 ml LB-Medium (1% Bacto Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl) mit Glucose (0,2%), Ampicillin (100 ug / ml) und Chloramphenicol (50 ug / ml) ergänzt. Bei 37 ° CO / N unter Schütteln bei 200 rpm inkubiert.
2. Impfen die 10 ml Vorkultur in 2 Liter des ergänzten LB-Medium wie oben. Wachsen die Zellen bei 37 ° C unter Schütteln bis OD ₆₀₀ erreicht 0,5.
3. Induzieren der Expression von MBP-Mgm101 Fusionsproteins durch Zugabe von Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 0,3 mM. Wachsen die Zellen unter Schütteln bei 30 ° C für 5 Stunden.
4. Sammeln der Zellen durch Zentrifugation unter Verwendung eines Beckman JA-10-Rotor (5.500 × g, 4 ° C, 10 min). Nachdem der Überstand verworfen, das Zellpellet in 30 ml Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 1 mM EDTA, pH 7,4), der Protease-Inhibitoren (25 uM Leupeptin, 1 uM Pepstatin A und 1 mM PMSF).
5. Beschallen Zellsuspension auf Eis für 20sec mit einem Ultraschall-Prozessor (Heat Systems; Modell W-385) bei 50% ED, ermöglichen, sich auf Eis für 30 sec abkühlen und 2x wiederholen.
6. 1 ml DNAse 1 stock bei 2 mg / ml. Rock the Zelllysat bei 4 ° C für 2 Stunden.
7. Stellen NaCl bis zu einer Endkonzentration von 500 mM.
8. Entfernen der Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 10.000 × g bei 4 ° C für 30 min.

2. Reinigung mit Amylose-Affinitätschromatographie

1. Äquilibrieren 1,5 ml Amylose-Harz (50% Suspension) in dem Lysepuffer. Fügen Sie das Gleichgewicht Amyloseharz dem Zelllysat. Schaukeln sanft bei 4 ° CO / N.
2. Legen Sie das Lysat-Harz-Mischung auf einer Econo-Column Chromatographie-Säule in einem kalten Raum installiert. Lassen Sie die ungebundenen Proteine, um die Spalte durch die Schwerkraft passieren.
3. Waschen der Amylose-Harz mit 300 ml Waschpuffer I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4 und 0,2 mM PMSF).
4. Wiederholen Sie die Wäsche mit 150 ml Waschpuffer II (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4 und 0,2 mM PMSF).
5. 5 ml Elutionspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4 und 0,2 mM PMSF, 10 mM Maltose) auf die Säule bei 4 ° C inkubiert für 10 Minuten, Sammeln das Eluat und wiederholen Sie für weitere Male.
6. Kombinieren der Eluate, bestimmen die Ausbeute und Reinheit der MBP-Mgm101 durch Laden eines Aliquots des Eluats auf einem SDS-PAGE-Gel von Coomassie-Färbung (Abbildung 4).

3. PreScission Proteasespaltung und Kationenaustausch-Chromatographie

1. In 50 Einheiten PreScission Protease an die MBP-Mgm101 Eluat. Führen die Spaltung bei 4 ° CO / N und lassen es während der Dialyse gegen Dialysepuffer weiter (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 100 mM NaCl; 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7,4 und 0,2 mM PMSF)
2. Prüfen Sie die Effizienz der Spaltung auf einem SDS-PAGE-Gel (Abbildung 5A).
3. Legen Sie das gespaltene MBP-Mgm101 von mehreren injizierenIonen auf einem Bio-Maßstab Mini Macro-Prep Hohe S Patrone zu einem Bio-Rad Biologic DuoFlow FPLC-System verbunden.
4. Starten Sie den Kationenaustauscherchromatographie durch Anlegen einer Schritt Salzgradient von 5 mm, 300 mm, 500 mm, 750 mm und 1000 mM NaCl, die durch Mischen von Puffer A (5 mM NaCl erstellt wird; 10 mM Na-Phosphat, pH 7,2; 1 mM PMSF) und Puffer B (1 M NaCl; 10 mM Na-Phosphat, pH 7,2; 1 mM PMSF). Stellen Sie den Durchfluss bei 0,5 ml / min. Sammeln Sie die Mgm101 Fraktion und überprüfen Sie die Reinheit des Proteins auf einem SDS-PAGE-Gel (Abbildung 5B).

4. Size Exclusion Chromatography

1. Kombinieren Sie die Proteinfraktionen aus Kationenaustauscherchromatographie. Dialyse des Proteins in GF Äquilibrierungspuffer (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 7,4, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,2 mM PMSF).
2. Konzentrieren des Proteins mit VIVASPIN 15R Ultrafiltration Spin-Säule, um die Lautstärke zu ~ 1 ml durch Spinnen bei 3.000 xg bei 4 ° C reduzieren
3. Legen Mgm101 ona kalibriert Superose 6 prep Grad Säule, die mit dem Chromatographie-Puffer (20 mM MOPS, pH 7,0; 150 mM NaCl; 5 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,2 mM PMSF).
4. Starten des Größenausschluss-Chromatographie mit dem Puffer bei einer Flussrate von 0,5 ml / min ausgeführt.
5. Sammeln Sie die Fraktionen der gereinigten Mgm101 Gipfeln. Legen Aliquots der Fraktionen auf einem 12% SDS-PAGE zur Überprüfung der Qualität des fertigen Protein.
6. Konzentrieren des Proteins mit VIVASPIN 6, dann schnell frieren die Proben in flüssigem N2 und bei -80 ° C
7. Verwenden Sie die Mgm101 Proben innerhalb von 6-12 Monaten für ssDNA-Bindungs-Assay (Abbildung 8) und für strukturelle Visualisierung mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie (Abbildung 9).

Ergebnisse

Mgm101 ist ein Rad52-bezogenen Rekombinationsprotein in Mitochondrien. Rad52 wurde ausgiebig für seine Rolle in der mitochondrialen DNA-Rekombination (Abbildung 1) untersucht. Rekombinante Mgm101 kann durch eine Drei-Schritt-Verfahren (Abbildung 2) hergestellt werden. Dies wird durch die Verwendung des MBP-Tagging Strategie Mgm101 in eine lösliche Form exprimiert werden und anschließend von dem Tag durch proteolytische Spaltung freigesetzt (Fig. 3) kann erleichtert. ...

Diskussion

Es war eine Herausforderung, um eine stabile, nativen rekombinanten Protein aus E. Mgm101 produzieren coli möglicherweise aufgrund seiner Unlöslichkeit in Bakterienzellen. In diesem Bericht zeigen wir, dass die MBP-Fusion-Strategie das Protein zu einem angemessen hohen Niveau exprimiert werden können. Durch negative Färbung Transmissionselektronenmikroskopie und Größenausschlusschromatographie, haben wir bereits gezeigt, dass die MBP-Fusionsprotein einheitliche Oligomere bildet in vitro ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expression vector pMAL-c2E	New England Biolabs	#N8066S
PreScission Protease	GE Healthcare Life Sciences	#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells	Strategene	#230245
Leupeptin	Roche Applied Science	#11034626001
Pepstatin	Roche Applied Science	#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Roche Applied Science	#10837091001
DNAse I	Sigma	#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Roche Applied Science	#11411446001
Amylose resin	New England Biolabs	#E8021L
Econo-Column chromatography column	BIO-RAD	#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)	BIO-RAD	#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS15RH02
Superose 6 prep grade column	Amersham Bioscirnces	#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS0611