Préparation de la recombinaison de protéines Mgm101 par la stratégie de marquage MBP basée

Résumé

La protéine de nucléoïde mitochondrial de la levure, Mgm101, est une protéine de recombinaison Rad52 type qui forme des gros anneaux oligomères. Un protocole est décrit pour préparer Mgm101 recombinant soluble avec la protéine de liaison du maltose (MBP)-tagging stratégie couplée avec échange de cations et la chromatographie d'exclusion stérique.

Résumé

Le gène a été identifié MGM101 il ya 20 ans pour son rôle dans le maintien de l'ADN mitochondrial. Études réalisées dans plusieurs groupes ont suggéré que la protéine Mgm101 est impliqué dans la réparation par recombinaison de l'ADN mitochondrial. Des études récentes ont indiqué que Mgm101 est lié à la famille des protéines de recombinaison Rad52 type. Ces protéines forment des anneaux oligomères et de promouvoir l'hybridation de molécules d'ADN simple brin homologue simples. Cependant, la caractérisation des Mgm101 a été entravée par la difficulté à produire la protéine recombinante. Ici, une procédure fiable pour la préparation recombinante de Mgm101 est décrite. Protéine liant le maltose (MBP) étiquetée Mgm101 est d'abord exprimé dans Escherichia coli. La protéine de fusion est d'abord purifié par chromatographie d'affinité en amylose. Après avoir été libéré par clivage protéolytique, Mgm101 est séparée de MBP par chromatographie d'échange cationique. Monodispersé Mgm101 est alors obtenuepar chromatographie d'exclusion de taille. Un rendement de ~ 0,87 mg de Mgm101 par litre de culture bactérienne peut être obtenue régulièrement. Le Mgm101 recombinante a un minimum de contamination de l'ADN. Les échantillons préparés sont utilisés avec succès pour biochimiques, structurelles et unique analyse d'images de particules de Mgm101. Ce protocole peut aussi être utilisé pour la préparation d'autres grandes protéines liant l'ADN oligomères qui peuvent être mal repliées et toxique pour les cellules bactériennes.

Introduction

La recombinaison homologue est important pour la réparation des cassures double-brin (CDB) et interbrins réticule, et pour la reprise de la réplication de l'ADN à partir des fourches de réplication effondrées ^1. En recombinaison homologue conventionnelle, la réaction central est catalysée par les recombinases ATP-dépendants dont RecA chez les procaryotes et Rad51 et Dmc1 chez les eucaryotes ^1-3. Ces recombinases former des filaments nucléoprotéiques sur ssDNA, qui sont essentiels pour initier recherche d'homologie et l'invasion de brin au sein de matrices d'ADN duplex (figure 1, cadre de gauche) ^4-7. En plus du schéma classique, la recombinaison homologue peut également avoir lieu d'une manière RecA/Rad51-independent (figure 1, cadre de droite). Par exemple, la levure RAD52 et Rad59 protéines peuvent directement catalyser le recuit de brins d'ADN simple brin complémentaires qui sont exposées par la résection des pauses ADN double brin. Ce processus de recombinaison, connu sous le nom chanterLe fil recuit, généralement n'implique pas appariement homologue des modèles ADN double brin. Après recuit, les queues hétérologues sont éliminés par des exonucléases et pseudos sont ligués pour restaurer ^8-10 continuité du génome. Réparation par le mécanisme de recuit simple brin est souvent accompagnée de suppressions de séquences génomiques entre les régions directement répétées.

Rad52 appartient à un groupe diversifié de protéines de recombinaison qui sont répandues parmi les bactériophages ^11. Ces protéines sont également connus comme simples protéines recuit Strand (SSAP), en fonction de leur activité dans la promotion de l'hybridation de molécules d'ADN simple brin homologue simples. Les meilleurs SSAP de bactériophages sont caractérisés Redβ et Erf du bactériophages λ et P22, RecT du prophage rac et la protéine Sak du phage lactococcal UL36. Les SSAP sont structurellement caractérisées par un pli β-β-β-α typique, bien similitude est pratiquement indétectablepouvoir dans leurs séquences primaires. Tous ces pays sont de grands anneaux homo-oligomères de 10-14 symétrie in vitro ^12-14. Les conséquences fonctionnelles de cet ordre organisation structurelle plus caractéristique n'est pas bien comprise.

Nous sommes intéressés à comprendre le mécanisme de recombinaison homologue dans le génome mitochondrial. Nous avons déjà identifié le gène MGM101 qui est essentielle pour le maintien de l'ADNmt dans Saccharomyces cerevisiae ^15. MGM101 a ensuite été trouvée associée avec nucléoïdes mitochondriales et est nécessaire pour la tolérance de l'ADNmt à des agents endommageant l'ADN ^16. Cependant, l'étude de Mgm101 a été retenu dans la dernière décennie par la difficulté de produire Mgm101 recombinant. Nous avons récemment réussi à produire Mgm101 soluble à de grandes quantités de E. coli en utilisant la stratégie de fusion MBP. Cela nous a permis de démontrer que Mgm101 actionssimilitudes biochimiques et structurales avec la Rad52-famille de protéines ^17,18. Dans ce rapport, une procédure de purification en trois étapes est décrite, qui produit Mgm101for analyses biochimiques et structurales homogènes (figure 2).

Protocole

Des études antérieures ont montré que les 22 premiers résidus amino-terminaux de Mgm101 sont clivés après l'importation dans les mitochondries ^19. Pour l'expression chez Escherichia coli, le cadre de lecture ouvert MGM101 dépourvue des 22 premiers codons est amplifié par PCR et placé en aval de la séquence malE codant pour la protéine de liaison du maltose (MBP), dans une version modifiée du vecteur d'expression pMAL-C2E. Ceci génère la fusion MBP-Mgm101 avec un élément de liaison contenant un site de clivage pour la protéase de PreScission (figure 3). Le plasmide est construit d'abord en sélectionnant E. transformants coli sans IPTG et la sélection bleu / blanc Xgal. Le plasmide pMAL-C2E-MGM101 résultant est ensuite introduit dans le E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL en sélectionnant l'ampicilline et les colonies résistantes au chloramphénicol.

1. Expression, Induction, lyse cellulaire et DNase I Traitement

1. Inoculer transformants fraîches dans 10 ml de milieu LB (1% Bactotryptone, 0,5% d'extrait de levure, NaCl 1%) additionné de glucose (0,2%), l'ampicilline (100 pg / ml) et le chloramphénicol (50 pg / ml). Incuber à 37 ° CO / N avec agitation à 200 rpm.
2. Inoculer le 10 ml de préculture dans 2 litres de milieu LB supplémenté comme ci-dessus. Cultiver les cellules à 37 ° C avec agitation jusqu'à _DO600 atteigne 0,5.
3. Induire l'expression de la protéine de fusion MBP-Mgm101 en ajoutant isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,3 mM. Cultiver les cellules avec pendant 5 heures sous agitation à 30 ° C.
4. Recueillir les cellules par centrifugation à l'aide d'un Beckman JA-10 rotor (5500 xg, 4 ° C, 10 min). Après élimination du surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 30 ml de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl, pH 7,4 et 1 mM EDTA, pH 7,4) contenant des inhibiteurs de la protéase (25 pM de leupeptine, 1 pM de pepstatine A et 1 mM PMSF).
5. Soniquer suspension cellulaire sur la glace pendant 20sec à l'aide d'un processeur ultra-sons (Systèmes de chaleur; modèle W-385) au cycle de service de 50%, laisser refroidir sur glace pendant 30 secondes, et répétez 2x.
6. Ajouter 1 ml de DNAse 1 stock à 2 mg / ml. Basculer le lysat de cellules à 4 ° C pendant 2 heures.
7. Ajuster NaCl à une concentration finale de 500 mM.
8. Retirer les débris cellulaires par centrifugation à 10 000 xg à 4 ° C pendant 30 min.

2. Purification avec amylose chromatographie d'affinité

1. Equilibrer 1,5 ml de résine d'amylose (50% suspension) dans le tampon de lyse. Ajouter la résine d'amylose équilibrée au lysat cellulaire. Balancer doucement à 4 ° CO / N.
2. Chargez le mélange lysat résine sur une colonne de chromatographie Econo-Colonne installé dans une chambre froide. Laisser les protéines non liées au passage de la colonne par gravité.
3. Laver la résine amylose avec 300 ml de tampon de lavage I (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 400 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, et 0,2 mM PMSF).
4. Répétez le lavage avec 150 ml de tampon de lavage II (20 mM TRis-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, et 0,2 mM PMSF).
5. Ajouter 5 ml de tampon d'élution (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, et 0,2 mM PMSF, 10 mM maltose) à la colonne, incuber à 4 ° C pendant 10 min, recueillir l'éluat et répéter pour plus de fois.
6. Combinez les éluats, déterminer le rendement et la pureté de MBP-Mgm101 en chargeant une aliquote de l'éluat sur ​​un gel SDS-PAGE suivie d'une coloration de Coomassie (Figure 4).

3. PreScission clivage de la protéase et Chromatographie d'échange de cations

1. Ajouter 50 unités de protéase PreScission à l'éluat MBP-Mgm101. Effectuer le clivage à 4 ° CO / N et lui permettre de continuer pendant la dialyse contre le tampon de dialyse (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 100 mM, DTT 2 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, et 0,2 mM PMSF)
2. Contrôler l'efficacité de clivage sur un gel SDS-PAGE (figure 5A).
3. Chargez le clivage MBP-Mgm101 par multiple injecterions sur une cartouche S Mini Macro-Prep Haute Bio-Scale connectés à un système FPLC DuoFlow biologique Bio-Rad.
4. Lancer la chromatographie d'échange de cations en appliquant un gradient par étape en sel de 5 mM, 300 mM, 500 mM, 750 mM et 1,000 mM de NaCl qui est créé par le mélange tampon A (NaCl 5 mM, 10 mM de phosphate de Na, pH 7,2; 1 mM PMSF) et le tampon B (1 M NaCl, 10 mM phosphate de sodium, pH 7,2, 1 mM PMSF). Régler le taux de débit de 0,5 ml / min. Recueillir la fraction Mgm101 et contrôler la pureté de la protéine sur un gel SDS-PAGE (figure 5B).

4. Chromatographie d'exclusion stérique

1. Réunir les fractions protéiques de la chromatographie d'échange de cations. Dialyser la protéine dans le tampon d'équilibrage GF (MOPS 20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4, 5 mM de 2-mercaptoéthanol, 0,2 mM PMSF).
2. Concentrer la protéine avec colonne de centrifugation ultrafiltration 15R VIVASPIN de réduire le volume de ~ 1 ml par centrifugation à 3000 xg à 4 ° C.
3. Chargez Mgm101 ona calibré Superose 6 prep colonne de qualité équilibrée avec le tampon de chromatographie (20 mM MOPS, pH 7,0, NaCl 150 mM, 5 mM β-mercaptoéthanol, 1 mM EDTA, pH 7,4, 0,2 mM PMSF).
4. Lancer l'exclusion de taille avec le tampon de chromatographie fonctionner à un débit de 0,5 ml / min.
5. Recueillir les fractions des pics Mgm101 purifiés. Charger des aliquotes des fractions sur un 12% SDS-PAGE pour vérifier la qualité finale de la protéine.
6. Concentré de la protéine avec VIVASPIN 6, puis congeler rapidement les échantillons dans N2 liquide et conserver à -80 ° C.
7. Utilisez les Mgm101 échantillons dans les 6-12 mois pour le dosage de fixation d'ADNss (Figure 8) et pour la visualisation de structure par microscopie électronique à transmission (figure 9).

Résultats

Mgm101 est une protéine de recombinaison Rad52 liée dans les mitochondries. RAD52 a été largement étudié pour son rôle dans la recombinaison de l'ADN mitochondrial (Figure 1). Recombinant Mgm101 peut être préparé par une procédure en trois étapes (figure 2). Ceci est facilité par l'utilisation de la stratégie MBP-tagging qui permet Mgm101 pour être exprimé sous une forme soluble et ensuite libéré de l'étiquette par clivage protéolytique (figure 3)...

Discussion

Il a été un défi pour produire une protéine stable, native recombinante Mgm101 de E. coli peut-être en raison de son insolubilité dans les cellules bactériennes. Dans ce rapport, nous montrons que la stratégie MBP-fusion permet à la protéine d'être exprimée à un niveau raisonnablement élevé. En utilisant une coloration microscopie électronique à transmission négative et la chromatographie d'exclusion stérique, nous avons précédemment montré que la protéine MBP-fusion forme des oli...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expression vector pMAL-c2E	New England Biolabs	#N8066S
PreScission Protease	GE Healthcare Life Sciences	#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells	Strategene	#230245
Leupeptin	Roche Applied Science	#11034626001
Pepstatin	Roche Applied Science	#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Roche Applied Science	#10837091001
DNAse I	Sigma	#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Roche Applied Science	#11411446001
Amylose resin	New England Biolabs	#E8021L
Econo-Column chromatography column	BIO-RAD	#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)	BIO-RAD	#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS15RH02
Superose 6 prep grade column	Amersham Bioscirnces	#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS0611