MBP tabanlı Etiketleme Stratejisi Mgm101 Rekombinasyon Protein hazırlanması

Özet

Maya mitokondriyal nükleoit proteini Mgm101, büyük oligomerik halkalar oluşturan bir Rad52 tipi rekombinasyon proteindir. Bir protokol, maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketleme katyon değişimi ve boyut dışlama kromatografisi ile birlikte stratejisi kullanılarak çözülebilir rekombinant Mgm101 hazırlamak için tarif edilmektedir.

Özet

MGM101 gen mitokondriyal DNA bakım rolü için 20 yıl önce tespit edilmiştir. Çeşitli gruplardan çalışmalar Mgm101 protein mitokondriyal DNA recombinational onarım dahil olduğunu ileri sürmüşlerdir. Son araştırmalar Mgm101 Rad52 tipi rekombinasyon protein aile ile ilgili olduğunu göstermiştir. Bu proteinler, büyük oligomerik halkaları oluşturmak ve homolog tek sarmallı DNA moleküllerinin tavlama teşvik eder. Bununla birlikte, Mgm101 karakterizasyonu, rekombinant proteinin üretiminde sekteye edilmiştir. Burada, rekombinant Mgm101 hazırlanması için bir güvenilir bir yöntem tarif edilmektedir. Maltoz bağlanma proteini (MBP)-etiketli Mgm101 olanlar, Escherichia coli içinde ifade edilir. Füzyon proteini, başlangıçta amiloz afinite kromatografisi ile saflaştırılır. Proteolitik bölünme ile serbest bırakıldıktan sonra, Mgm101 katyon değişim kromatografisi ile MBP ayrılır. Monodispers Mgm101 daha sonra elde edilirboyut dışlama kromatografisi ile. Bakteri kültürü litre başına Mgm101 bir ~ 0.87 mg verim rutin elde olabilir. Rekombinant DNA Mgm101 asgari kirlenme vardır. Hazırlanan numunelerin başarıyla Mgm101 biyokimyasal, yapısal ve tek bir parçacık resim analizleri için kullanılır. Bu protokol, aynı zamanda yanlış katlanmış ve bakteri hücreleri için toksik olabilir diğer büyük oligomerik DNA bağlayıcı proteinlerin hazırlanması için kullanılabilir.

Giriş

Homolog rekombinasyon çift iplikli sonları tamiri (DSBs) ve zincirler arası çapraz bağlar, ve çökmüş çoğaltma çatal ¹ DNA replikasyon reinitiation için önemlidir. Geleneksel homolog rekombinasyon, merkez reaksiyon Prokaryotlarda RecA ve RAD51 ve ^1-3 ökaryotlarda Dmc1 da dahil olmak üzere, ATP-bağımlı rekombinaz tarafından katalize edilir. Bu rekombinaz dubleks DNA şablonları (Şekil 1, sol panel) ^4-7 içinde homoloji arama ve iplikçik işgali başlatmak için gerekli olan ssDNA, üzerinde nükleoprotein filamentler oluştururlar. Geleneksel programına ilave olarak, aynı zamanda, bir homolog rekombinasyon RecA/Rad51-independent şekilde (Şekil 1, sağ panel) içerisinde yer alabilir. Örneğin, maya Rad52 ve Rad59 proteinler doğrudan dsDNA tatili geriden kestirmeye tarafından sunulan tamamlayıcı ssDNA ipliklerini tavlama katalize edebilir. Şarkı olarak bilinen bu rekombinasyon işlemi,le iplikçik tavlama, genellikle homolog dsDNA şablonları ile eşleştirme anlamına gelmez. Tavlama işleminden sonra, heterolog kuyrukları exonucleases ile çıkarılır ve çentikler genom süreklilik ^8-10 geri ligate edilir. Tek tel çekme mekanizması ile tamir genellikle doğrudan tekrar bölgeleri arasında genom dizilerinin silinmesi eşlik eder.

Rad52 bakteriyofajlar ¹¹ arasında yaygın olan rekombinasyon proteinlerin çeşitli bir grup aittir. Bu proteinler aynı zamanda, homolog tek sarmallı DNA moleküllerinin tavlama teşvik etmedeki aktiviteleri göre, tek tel çekme Proteinleri (SSAPs) olarak bilinir. En iyi karakterize bakteriyofaj SSAPs Redβ ve laktokokkal faj ul36 gelen profajının rac ve Sak protein bakteriyofajlar λ ve P22, rect gelen Erf vardır. Benzerlik neredeyse undetect rağmen SSAPs yapısal olarak, tipik bir β-β-β-α kat ile karakterize edilirbirincil dizileri mümkün. 10 Onlar tüm form büyük homo-oligomerik halkaları - in vitro ^12-14 14 kat simetri. Bu özelliği yüksek mertebeden yapısal organizasyonun fonksiyonel etkileri iyi anlaşılmış değildir.

Biz mitokondriyal genom homolog rekombinasyon mekanizması anlamada ilgilendi. Daha önce, Saccharomyces cerevisiae ¹⁵ mtDNA bakımı için gerekli olan MGM101 gen tanımlanmıştır. MGM101 sonradan mitokondriyal nukleoidler ile ilişkili olduğu bulunmuştur ve DNA'ya zarar veren ajanlara mtDNA tolerans ¹⁶ için gereklidir. Ancak, Mgm101 çalışma rekombinant Mgm101 üretmek için zorluk tarafından son on yılda geri gerçekleştirildi. Biz son zamanlarda E. büyük miktarlarda çözünür Mgm101 üretiminde başardı MBP-füzyon strateji kullanarak coli. Bu bize Mgm101 hisse göstermek sağladıprotein ^17,18 en Rad52 aile ile biyokimyasal ve yapısal benzerlikler. Bu raporda, üç aşamalı bir saflaştırma prosedürü homojen Mgm101for biyokimyasal ve yapısal analizleri (Şekil 2) üretir, tarif edilmektedir.

Protokol

Önceki çalışmalar Mgm101 ilk amino terminal kalıntıları 22 mitokondri ¹⁹ içine aldıktan sonra yarıldığı gösterilmiştir. Escherichia coli içinde ekspresyonu için, ilk 22 kodonları eksik MGM101 açık okuma çerçevesi PCR ile amplifiye edilir ve ekspresyon vektörü üretilmesinde ise pMAL-C2E değiştirilmiş bir versiyonu maltoz bağlayıcı protein (MBP) kodlayan bir erkek sekansının aşağı yerleştirilir. Bu PreScission proteaz (Şekil 3), bir ayrılma yeri içeren bir bağlayıcı ile MBP-füzyon Mgm101 oluşturur. Plazmid ilk olarak E. seçerek inşa IPTG ve Xgal beyaz / mavi seçim olmadan coli transformantlar. Elde edilen plazmid üretilmesinde ise pMAL-C2E-MGM101 sonra E. sokulur coli ampisilin ve kloramfenikol dirençli koloniler seçerek BL21-CodonPlus (DE3)-RIL süzün.

1. İfade, İndüksiyon, Hücre Lizis ve DNaz I Tedavi

1. Inocglikoz (% 0.2), ampisilin (100 ug / ml) ve kloramfenikol (50 ug / ml) ile desteklenmiş LB vasatı içinde 10 ml (% 1 Bacto Tripton,% 0.5 maya ekstresi,% 1 NaCl) taze transformantlar ulate. 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° CO / K 'de inkübe edilir.
2. Yukarıdaki gibi desteklenmiş LB vasatı içinde 2 litre içine 10 ml ön-kültür inoküle. OD ₆₀₀ 0.5 ulaşıncaya kadar sallayarak ile 37 ° C hücreleri büyütün.
3. 0.3 mM'lik bir son konsantrasyonda izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) eklenerek MBP-Mgm101 füzyon proteininin ekspresyonunu. 5 saat 30 ° C'de sallayarak hücreleri büyütün.
4. Bir Beckman JA-10 rotoru (5500 x g, 4 ° C, 10 dakika) kullanılarak santrifüj hücreleri toplamak. Atıldıktan sonra, süpernatan, proteaz inhibitörleri (25 uM löpeptin, 1 uM pepstatin A ve 1 mM PMSF) ihtiva eden liziz tamponu, 30 ml (20 mM Tris-HCI, pH 7.4 ve 1 mM EDTA, pH 7.4) içinde hücre pelletini.
5. 20 boyunca buz üzerinde hücre süspansiyonu sonikasyonsn ultrasonik işlemci (Isı Sistemleri; Model W-385) kullanarak 50% görev döngüsü, 30 saniye boyunca buz üzerinde serin ve 2x tekrar sağlar.
6. 2 mg / ml 'de 1 DNAz stoklar 1 ml ilave edilir. 2 saat boyunca 4 ° C 'de hücre lizatı sallayın.
7. 500 mM'lik bir son konsantrasyona NaCl ayarlayın.
8. 30 dakika boyunca 4 ° C'de 10,000 x g'de santrifüj ile hücre artıkları çıkarın.

2. Amiloz Affinity Kromatografi ile Arıtma

1. Lizis tamponu içinde amiloz reçinesi (% 50 çamurlu) 1.5 ml dengelenmesi. Hücre lizatı ile dengelenmiş amiloz reçine ekleyin. 4 ° CO / N. de hafifçe sallayın
2. Soğuk bir odaya monte bir Econo-Kolon kromatografisi kolonuna lizat-reçine karışımı yükleyin. Ilişkisiz proteinler yerçekimi ile sütun geçmesine izin.
3. Yıkama tamponu I (, 400 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF, 20 mM Tris-HCI, pH 7.4) 300 mL 'si ile yıkayınız amiloz reçine.
4. II yıkama tamponu (20 mM T 150 mL 'si ile yıkama tekrarlayınRIS-HCI, pH 7.4, 200 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF).
5. Sütun, 4 'de inkübe edilir 10 dakika boyunca ° C toplamak elüsyon tamponu, 5 ml (, 200 mM NaCI;, 1 mM EDTA, pH 7.4 ve 0.2 mM PMSF, 10 mM Maltoz, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4) ile ekleme daha fazla kez eluat ve tekrar.
6. Eluatlar birleştirin, Coomassie boyama (Şekil 4) tarafından izlenen bir SDS-PAGE jeli üzerinde eluatın bir kısım yükleyerek MBP-Mgm101 verimini ve saflığını belirlemek.

3. PreScission proteaz bölünme ve Katyon Değişim Kromatografisi

1. MBP-Mgm101 elüatına PreScission proteaz 50 adet ekleyin. 4 de bölünme ° CO / N yapın ve (20 mM Tris-HCI, pH 7.4, 100 mM NaCI, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7.4, ve 0.2 mM PMSF) bu diyaliz tampon maddesine karşı diyaliz süresince devam etmesine izin
2. Bir SDS-PAGE jel (Şekil 5A) üzerinde bölünme verimini kontrol edin.
3. Birden enjekte tarafından bölünmüş MBP-Mgm101 YükBio-Ölçek Mini Makro-Hazırlık Yüksek S kartuşu iyonları bir Bio-Rad Biyolojik Çift Geçişli FPLC sistemine bağlı.
4. Bir adım tuzu 5 mM gradyan, 300 mM, 500 mM, 750 mM ve karıştırma tampon A (5 mM NaCI ile oluşturulur NaCl 1.000 mm uygulayarak, katyon değişim kromatografisi başlangıç;, 10 mM Na-fosfat, pH 7.2, 1 mM PMSF) ve Tampon B (1 M NaCI, 10 mM Na-fosfat, pH 7.2, 1 mM PMSF). 0.5 ml / dak akış hızı. Mgm101 fraksiyonu toplamak ve bir SDS-PAGE jel (Şekil 5B), proteinin saflığı gösterir.

4. Boyut Dışlama Kromatografisi

1. Katyon değişim kromatografisinden protein fraksiyonları bir araya getirin. (150 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH 7.4, 5 mM 2-merkaptoetanol, 0.2 mM PMSF, 20 mM MOPS, pH 7.0) GF dengeleme tamponu içinde protein Dialyze.
2. 4 ° C'de 3000 xg'de iplik ~ 1 ml hacmini azaltmak için Vivaspin 15R Ultrafiltrasyon spin kolon ile protein konsantre
3. Mgm101 o Yükna kromatografi tamponu (150 mM NaCI, 5 mM β-merkaptoetanol, 1 mM EDTA, pH 7.4, 0.2 mM PMSF, 20 mM MOPS, pH 7.0) ile dengelenmiş bir Superpose 6 prep kolon dereceli olarak kalibre edilmiştir.
4. 0.5 ml / dak 'lık bir akış hızında çalışırlar kromatografi tamponu ile boyut dışlama başlatın.
5. Saflaştırılmış Mgm101 tepe fraksiyonlar toplayın. Protein nihai kalitesini kontrol etmek için, bir% 12 SDS-PAGE üzerinde fraksiyonların alikotları yerleştirin.
6. Vivaspin 6 ile protein konsantre, sonra hızlı bir şekilde -80 sıvı N2 ve mağaza örnekleri dondurmak ° C
7. SsDNA bağlayıcı analizi (Şekil 8) ve transmisyon elektron mikroskobu (Şekil 9) ile yapısal görselleştirme için 6-12 ay içinde Mgm101 örnekleri kullanın.

Sonuçlar

Mgm101 mitokondri bir Rad52 ilgili rekombinasyon proteindir. Rad52 yoğun mitokondriyal DNA rekombinasyon (Şekil 1) rolü için incelenmiştir. Rekombinant Mgm101 üç aşamalı bir prosedür (Şekil 2) ile hazırlanabilir. Bu Mgm101 çözünür bir biçimde ifade edilir ve daha sonra (Şekil 3) proteolitik bölünme ile etiketinden açığa çıkmasına izin veren MBP-etiketleme stratejisinin kullanımı ile kolaylaştırılır.

Tipik bir ...

Tartışmalar

E. bir istikrarlı, yerli rekombinant Mgm101 proteini üretmek için bir meydan okuma olmuştur bakteri hücrelerinin kendi çözünürlükten muhtemelen nedeniyle coli. Bu raporda, MBP-füzyon stratejisi protein oldukça yüksek bir seviyede ifade edilmesini sağlar olduğunu göstermektedir. Negatif boyama transmisyon elektron mikroskopisi ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak, daha önce MBP-füzyon proteininin in vitro ¹⁸ üniform oligomerleri oluşturur göst...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Expression vector pMAL-c2E	New England Biolabs	#N8066S
PreScission Protease	GE Healthcare Life Sciences	#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cells	Strategene	#230245
Leupeptin	Roche Applied Science	#11034626001
Pepstatin	Roche Applied Science	#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Roche Applied Science	#10837091001
DNAse I	Sigma	#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Roche Applied Science	#11411446001
Amylose resin	New England Biolabs	#E8021L
Econo-Column chromatography column	BIO-RAD	#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)	BIO-RAD	#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS15RH02
Superose 6 prep grade column	Amersham Bioscirnces	#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)	Sartorius Stedium	#VS0611