JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Митохондриальных белков дрожжей нуклеоидом, Mgm101, является Rad52 типа рекомбинации белок, который образует крупные олигомерные кольцами. Протокол описан подготовить растворимых рекомбинантных Mgm101 использованием белок, связывающий мальтозу (МВР)-тегов стратегия в сочетании с катионообменной хроматографии и гель.

Аннотация

Ген MGM101 был определен 20 лет назад за его роль в поддержании митохондриальной ДНК. Исследования, проведенные в нескольких группах показали, что белок Mgm101 участвует в рекомбинационной репарации митохондриальной ДНК. Недавние исследования показали, что Mgm101 связана с Rad52 типа белка семейства рекомбинации. Эти белки образуют крупные олигомерные кольца и содействие отжига гомологичных одноцепочечной молекулы ДНК. Тем не менее, характеристика Mgm101 было затруднено из-за сложности в производстве рекомбинантного белка. Здесь надежный способ получения рекомбинантного Mgm101 описано. Белок, связывающий мальтозу (МВР) с метками Mgm101 впервые экспрессируется в E. coli. Слитый белок сначала очищали аффинной хроматографией амилозы. После освобождения путем протеолитического расщепления, Mgm101 отделена от MBP с помощью хроматографии катионного обмена. Монодисперсные Mgm101 затем получаютпо размеру хроматографии. Выход ~ 0,87 мг Mgm101 на литр бактериальной культуры может быть получена регулярно. Рекомбинантный Mgm101 имеет минимальное загрязнение ДНК. Подготовленные образцы успешно используются для биохимических, структурных и одна частица изображений анализы Mgm101. Этот протокол может также использоваться для получения других больших олигомерные ДНК-связывающих белков, которые могут быть неправильно свернутых и токсичными для бактериальных клеток.

Введение

Гомологичной рекомбинации важных для ремонта разрывов двойной нити (ДР) и interstrand поперечные связи, а для повторной инициации репликации ДНК из-под разрушенных вилки репликации 1. В обычной гомологичной рекомбинации, центральный реакция катализируется АТФ-зависимый рекомбиназы включая RecA у прокариот и Rad51 и Dmc1 у эукариот 1-3. Эти рекомбиназ образуют нуклеопротеином нитей на одноцепочечной ДНК, которые необходимы для начала поиска гомологии и прядь вторжения в дуплекс ДНК-матриц (рис. 1, слева) 4-7. В дополнение к обычной схеме, гомологичной рекомбинации также может иметь место в RecA/Rad51-independent образом (рис. 1, справа). Например, дрожжи Rad52 и Rad59 белки могут непосредственно катализировать отжига комплементарных нитей оцДНК, которые подвергаются по резекции разрывов двухцепочечной ДНК. Этот процесс рекомбинации, известный как петьLe прядь отжига, как правило, не связаны с гомологичными сопряжения с шаблонами двухцепочечной ДНК. После отжига гетерологичных хвосты удаляются экзонуклеазами и ники лигируют к восстановлению 8-10 геном непрерывности. Ремонт по одной пряди механизмом отжига часто сопровождается делеции геномных последовательностей между непосредственно повторяется регионах.

Rad52 принадлежит разнообразная группа белков, которые рекомбинации широко распространены среди бактериофагов 11. Эти белки также известны как Одноместный Strand отжига Белки (SSAPs), основанный на их деятельности в продвижении отжига гомологичных одноцепочечной молекулы ДНК. Лучше всего характеризует SSAPs бактериофага Redβ и Erf от бактериофагов λ и Р22, прямоугольный от профаге RAC и белок от Сак lactococcal ul36 фага. SSAPs структурно характеризуется типичным β-β-β-α раза, хотя сходство практически undetectсостоянии в их первичных последовательностей. Все они образуют большие гомо-олигомерных кольца из 10 - 14 кратной симметрии в пробирке 12-14. Функциональное значение этой характеристики высшего порядка структурной организации не очень хорошо понял.

Мы заинтересованы в понимании механизма гомологичной рекомбинации митохондриального генома. Ранее мы уже определили MGM101 ген, который имеет важное значение для поддержания мтДНК в Saccharomyces CEREVISIAE 15. MGM101 Впоследствии было обнаружено, связаны с митохондриальной нуклеоидах и необходима для допуска мтДНК с ДНК-повреждающих агентов 16. Тем не менее, изучение Mgm101 был проведен еще в последнее десятилетие из-за сложности для получения рекомбинантного Mgm101. Мы недавно удалось получить растворимые Mgm101 в больших количествах из E. палочка помощью MBP-Fusion стратегии. Это позволило нам продемонстрировать, что Mgm101 акцийбиохимические и структурные сходства с Rad52-семейства белков, 17,18. В этом отчете, трехступенчатой ​​очистки процедура описана, который производит однородную Mgm101for биохимических и структурного анализа (рис. 2).

протокол

Предшествующие исследования показали, что первый аминоконцевой 22 остатков Mgm101 расщепляются после импорта в митохондрии 19. Для экспрессии в E. coli, MGM101 открытую рамку считывания, лишенный первых 22 кодона, амплифицируют с помощью ПЦР и размещенный ниже по течению от мужской последовательности, кодирующей белок, связывающий мальтозу (MBP) в модифицированной версии вектора экспрессии pMAL-Н2О. Это создает MBP-Mgm101 слияния с линкер, содержащий сайт расщепления протеазы PreScission (рис. 3). Плазмиды впервые построены выбрав E. палочка трансформантах без IPTG и Xgal синий / белый выбора. Полученную в результате плазмиду pMAL-Н2О-MGM101 затем вводят в E. штамме BL21-CodonPlus (DE3)-RIL, выбрав ампициллин и хлорамфеникол колонии, устойчивые.

1. Выражение, индукция, лизис клеток и ДНКаза I Лечение

  1. INOCУлате свежий трансформантов в 10 мл LB-среды (1% бактотриптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl) с добавлением глюкозы (0,2%), ампициллин (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (50 мкг / мл). Инкубировать при 37 ° CO / N при встряхивании при 200 оборотах в минуту.
  2. Инокулируют 10 мл предварительной культуры в 2 л дополнен LB средой, как указано выше. Расти клетки при 37 ° С с перемешиванием, пока OD 600 не достигнет 0,5.
  3. Индуцируют экспрессию MBP-Mgm101 слитого белка путем добавления изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 0,3 мМ. Расти клетки при встряхивании при 30 ° C в течение 5 часов.
  4. Собирают клетки центрифугированием использованием Beckman JA-10 роторе (5500 мкг, 4 ° С, 10 мин). После удаления супернатанта, ресуспендируют осадок клеток в 30 мл лизирующего буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4 и 1 мМ ЭДТА, рН 7,4), содержащим ингибиторы протеаз (25 мкМ лейпептина, 1 мкМ пепстатина и 1 мМ PMSF).
  5. Разрушать ультразвуком клеточной суспензии на льду в течение 20с использованием ультразвукового процессора (Отопительные системы, модель W-385) при 50% рабочем цикле, дать остыть на льду в течение 30 сек, и повторяется 2 раза.
  6. Добавить 1 мл 1 ДНКазе акции по 2 мг / мл. Rock клеточного лизата при 4 ° С в течение 2 часов.
  7. Регулировка NaCl до конечной концентрации 500 мМ.
  8. Удалить клеточного дебриса путем центрифугирования при 10000 х г при 4 ° С в течение 30 мин.

2. Очистка с помощью аффинной хроматографии Амилоза

  1. Равновесие 1,5 мл амилозы смола (50% суспензии) в буфере для лизиса. Добавить уравновешенной смолы амилозы к клеточного лизата. Rock осторожно при 4 ° CO / N.
  2. Загрузите лизатом смолы смеси на Econo-колонки хроматографии установлен в холодном помещении. Разрешить несвязанных белков передать колонку под действием силы тяжести.
  3. Промыть амилозы смола 300 мл промывочного буфера I (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 400 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, и 0,2 мМ PMSF).
  4. Повторите мыть с 150 мл промывочного буфера II (20 мм тс.п.-HCl, рН 7,4, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, и 0,2 мМ PMSF).
  5. Добавляют 5 мл элюирующего буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, и 0,2 мМ PMSF, 10 мМ мальтозы) в колонну, инкубируют при 4 ° С в течение 10 мин, собирают элюата и повторить в течение более раз.
  6. Смешайте элюата, определяют выход и чистоту MBP-Mgm101 путем загрузки аликвоты элюата на SDS-PAGE геле с последующим окрашиванием кумасси (рис. 4).

3. PreScission расщепления протеазы и катионообменной хроматографии

  1. Добавить 50 единиц протеазы PreScission к MBP-Mgm101 элюата. Выполнение расщепления при 4 ° CO / N и дать ему возможность продолжаться в течение диализом против буфера для диализа (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 100 мМ NaCl, 2 мМ DTT, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, и 0,2 мМ PMSF)
  2. Проверьте эффективность расщепления на SDS-геле (рис. 5а).
  3. Загрузите расщепленной MBP-Mgm101 несколькими инъекционныеионов на Bio-Scale Картридж Мини Макро-Prep Высокая S подключен к Bio-Rad Биологические системы двухпоточное FPLC.
  4. Начало катионообменной хроматографии с применением ступенчатого градиента соли 5 мМ, 300 мМ, 500 мМ, 750 мМ и 1000 мМ NaCl, которая создается путем смешивания буфера (5 мМ NaCl, 10 мМ Na-фосфат, рН 7,2, 1 мМ PMSF) и буфера B (1 М NaCl, 10 мМ Na-фосфат, рН 7,2, 1 мМ PMSF). Установить расход при 0,5 мл / мин. Собирают фракции Mgm101 и проверки чистоты белка на SDS-PAGE геле (фиг. 5В).

4. Эксклюзионной хроматографии

  1. Объедините белковых фракций из катионообменной хроматографии. Диализировать белка в GF уравновешивающим буфером (20 мМ MOPS, рН 7,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,2 мМ PMSF).
  2. Концентрат белка с Vivaspin 15R колонке спина ультрафильтрации для уменьшения объема до ~ 1 мл центрифугированием при 3000 мкг при 4 ° С.
  3. Загрузите Mgm101 Oпа калиброванный Superose 6 подготовительной класс колонку, уравновешенную хроматографии буфера (20 мМ MOPS, рН 7,0, 150 мМ NaCl, 5 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4, 0,2 мМ PMSF).
  4. Начало эксклюзионной хроматографии с буфером работать при скорости потока 0,5 мл / мин.
  5. Собирают фракции очищенного Mgm101 пиков. Загрузка аликвоты фракций на 12% SDS-PAGE для проверки качества конечного белка.
  6. Концентрат белка с Vivaspin 6, а затем быстро заморозить образцы в жидком N2 и хранят при -80 ° С.
  7. Используйте Mgm101 образцы в течение 6-12 месяцев для одноцепочечной ДНК-анализа связывания (рис. 8) и для структурной визуализации с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рис. 9).

Результаты

Mgm101 является Rad52 связанных рекомбинации белка в митохондриях. Rad52 была тщательно изучена за его роль в митохондриальной ДНК-рекомбинации (рис. 1). Рекомбинантный Mgm101 могут быть получены тремя этапами процедуры (рис. 2). Этому способствует использование MBP-тегов стратеги?...

Обсуждение

Это был вызов для получения стабильного, родные рекомбинантного белка из Mgm101 E. кишечной возможно, из-за его нерастворимость в бактериальных клетках. В этом докладе, мы покажем, что MBP-Fusion стратегии позволяет белку быть выражены на достаточно высоком уровне. При использовании отриц?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Стефан Wilkens за помощью в просвечивающей электронной микроскопии. Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грант R01AG023731.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Expression vector pMAL-c2ENew England Biolabs#N8066S
PreScission ProteaseGE Healthcare Life Sciences#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cellsStrategene#230245
LeupeptinRoche Applied Science#11034626001
PepstatinRoche Applied Science#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche Applied Science#10837091001
DNAse ISigma#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Roche Applied Science#11411446001
Amylose resinNew England Biolabs#E8021L
Econo-Column chromatography columnBIO-RAD#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)BIO-RAD#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)Sartorius Stedium#VS15RH02
Superose 6 prep grade columnAmersham Bioscirnces#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)Sartorius Stedium#VS0611

Ссылки

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

76Mgm101Rad52

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены