מבצע של Bioreactor Benchtop

Summary

Fermentors משמשים כדי להגדיל את תשואת התרבות והפרודוקטיביות של תאים מהונדסים גנטיים. לאחר הקרנת מועמדי תרבית תאים של חיידקים או של בעלי חיים רבים בצלוחיות לרעוד, הצעד ההגיוני הבא הוא להגדיל ביומסה של התרבות שנבחרה עם fermentor. סרטון זה מדגים את ההקמה ותפעול של מערכת bioreactor המעבדתיים אופיינית.

Abstract

מערכות תסיסה משמשות כדי לספק סביבת גידול אופטימלית לסוגים רבים ושונים של תרביות תאים. היכולת המוענקת על ידי fermentors לשלוט בזהירות טמפרטורה, pH, וריכוזי חמצן מומסים בפרט הופכת אותם חיונית לצמיחה גדולה בקנה מידה יעילה וביטוי של מוצרי תסיסה. וידאו זה יתאר בקצרה את היתרונות של fermentor על הבקבוק שייק. זה יהיה גם לזהות מרכיבים עיקריים של מערכת תסיסה המעבדתיים אופיינית ונותן הדרכה בסיסית בהתקנה של כלי השיט והכיול של הבדיקות שלה. הצופה יהיה להכיר את תהליך העיקור והראה כיצד לחסן מדיום הגידול בכלי עם תרבות. מושגים בסיסיים של פעולה, דגימה, וקציר יהיו גם הוכיחו. ניתוח נתונים פשוט וניקוי המערכת יהיה גם דנו.

Introduction

טכנולוגית תסיסה בסיסית היא הרחבה של טכניקת הבקבוק לנער הפשוטה לגידול בתרבית. הוא צמח מתוך הרצון לשלוט סביבות צמיחה לתרבויות לחיות באופן שלם יותר וכמותיים. צלוחיות לרעוד התרבות אצווה בדרך כלל מוגבלות על ידי בקרה מדויקת של טמפרטורה. אחידות טמפרטורה שבייקרה מודגרות או חדר חם הוא משתנה מאוד, לפעמים סוטה 5 מעלות צלזיוס או יותר מsetpoint המיועד. מאז את הבקבוק לנער בדרך כלל נסער במהירות קבועה, חילופי ספיגת חמצן וגז הוא מוגבלים. ברגע שחמצן הסביבה זמין יגמר, רוב התרבויות לא יצליחו לשגשג. אין בקרת pH בצלוחיות לרעוד. במקרים רבים, אם התרבות אינה מוגבלת על ידי מניות הזנה, הוא הופך להיות חומצי עד לנקודה של אובדן לתרבות ונשימה מאטה באופן דרמטי. רוב תרבויות בקבוק לנער גם מנוהלות כמו 'אצווה', מה שאומר שהם האכילו רק פעם אחת או בסמוך לתחילתה של תרבויות inoculation. לאחר מקור פחמן ראשוני זה הוא נצרך, התרבות מפסיקה לגדול. בחלק מהמקרים את חילוף החומרים שלה עשויים לעבור ולהתחיל לצרוך מטבוליטים אחרים במרק התרבות, לפעמים משנים את המאפיינים של ביומסה או חלבון כתוצאה. צלוחיות Shake הן גם בדרך כלל בכפוף לאובדן אוויר תקשורת בסביבות תרבות חמה, בדרך כלל 10% מנפח ל24 שעות על 37 ° C. הפסד זה משנה את הצפיפות של התרבות ואוסר על פעולה לטווח ארוכה יותר של המערכת. לבסוף, המשתמש עשוי להיתקל בקצף מהתקשורת לאחר תסיסה. המופע של קצף באמיץ מעל לתרבות יגביל חילוף גזים וצמיחה להחניק נוספת.

מערכת התסיסה הבסיסית נועדה לטפל בכל המגבלות האלה. בקרת טמפרטורה זהירה מושגת בכלי תסיסה על ידי השימוש בתסיסה מאיץ וז'קט חימום. חיישן מוכנס לתוך כלי השליטה ומשוב של חימום וקירור של מעיל זה בדרך כללתוצאות בבקרת טמפרטורת ± 0.1 מעלות צלזיוס סביב setpoint. fermentors benchtop בדרך כלל מספק שליטה של ​​ה-pH באמצעות בנוסף מגיב נוזל דרך משאבה. ערך ה-pH הוא פיקוח ברציפות במאמץ לשמור על הסביבה אופטימלית לגדילת תאים. אוורור נאות מתוחזק על ידי מאיץ הערבוב האמור או על ידי העירוי של אוויר או גז חמצן בתוספת ישירות לתוך התרבות. עם תרבויות גזירה רגישה, גז חמצן בתוספת הוא המנגנון העיקרי לשמירה על רמת חמצן בתרבות. מדידת חמצן בפתרון מושגת בדרך כלל על ידי בדיקה polarographic שהיא בדרך כלל לא זמין לשימוש בבקבוקונים שייק. אפשר גם לרציפות או מעת לעת להוסיף עדכון לכלי כדי לשמור על הצמיחה באופן ליניארי או מעריכי. הקבל גז היציאה מספק משטח קר לאדים בזרימת גז הפליטה להתעבות, ובכך לשמר את תרבות נפח וצפיפות. בנוסף תקופתי של פעילי שטח antifoam הוא מופעלעל ידי בדיקה מוליכות בתרבות, הפחתת קצף על פני השטח ומאפשר חילוף גזים.

כלי השיט, עם כל הבדיקות, אביזרים, מדחפים, צינורות קציר, וצינורות, מורכב ומעוקרים בחיטוי רגיל. לאחר כיולי בדיקה סופית וייצוב לסביבת הפעלה, התרבות מתווספת לכלי השיט. המערכת לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לאפיין את התרבות באופן שהוא יותר כמוני ומדויק יותר מאשר בשיטת בקבוק לרעוד. פיקוח הדוק של טמפרטורה, pH, תכולת חמצן, צריכת מזון, אידוי נוזל, ורמות קצף, כל אלה תורמים לביומסה הרבה יותר גבוהה ותשואת חלבון טובה יותר.

Protocol

1. בגין פעולה עם התקנת כלי. יש fermentor קונבנציונלי הרכיבים הבאים שצריך להיות מותקן (איור 1):
   1. הבדיקה ה-pH - למדידה של ה-pH בתרבות החי. לכייל את הבדיקה לפני ההתקנה ולחטא עם הכלי. התקן את הבדיקה בheadplate.
   2. ת.ד. ₂ חללית - למדידת תכולת חמצן מומסת בתוך הכלי במהלך תסיסה. התקן בheadplate.
   3. צינור קציר לדגימת התרבות. התקן את רכיב גובה מתכוונן זה בheadplate.
   4. sparger גז - שוכן בחלק התחתון של הכלי ומספק עירוי גז לתרבות. הוק sparger עד למקור הגז בfermentor והר בheadplate.
   5. צינור מאיץ ומאיץ - המאיץ מעורר את התרבות והוא קריטי לשמירה על אחידות תרבות בכלי השיט.
   6. הקבל גז פליטה - לבלימת ירידה באוויר בכלי על ידי קירור נתיב גז הפליטה.
   7. קווי משאבה מגיב לבקרת pH או תוספת הזנה.
2. נקה את הכלי וheadplate עם מים וסבון. מברשת רכה מומלצת לקרצוף הכלי וheadplate. לא ניתן להשתמש באקונומיקה או בחומרי ניקוי עם כלור כדי לנקות את כלי השיט.
3. אם התקשורת לא לחמם יציבה, להוסיף אותו לכלי הנקי. להוסיף רק עד למקסימום עבודה נפח. במקרה זה, מרבית העבודה הנפח הוא 3.3 L לכלי סך נפח 5 ליטר.
4. הר headplate הכלי, על מנת להבטיח כי חותם O-הטבעת יושב כמו שצריך.
5. התקן את הקבל גז הפליטה.
6. התקן את הבדיקה antifoam ליציאת 10 מ"מ שלה.
7. התקן את צינור הקציר ליציאת 10 מ"מ שלה. שים חתיכת הצינור בחלק העליון שלו ותכניס אותו.
8. התקנת צינורות ומסנן 0.20 מיקרומטר על הכניסה המתיזה ולאחר מכן מהדק את זה.
9. כייל את הבדיקה ה-pH:
   1. לאסוף 2 מאגרי התייחסות בכוסות קטנות, בקבוק לשטוף, ווא חילוףכוס sh.
   2. הוק את החללית מעלה החומציות לfermentor ולהפוך fermentor הלאה.
   3. גלול לפרמטר ה-pH ושימוש בלחצן התפריט, גלול לאפשרות 'קאל', ועל 'Enter'.
   4. בחר '2 'לכיול 2 נקודות.
   5. לשטוף את הקצה החללית ולצלול במאגר ההתייחסות הנמוך. הערך על fermentor יתייצב. באמצעות + ו - מפתחות, להתאים את הערך מוצג כדי להתאים את ערכו של מאגר התייחסות ה-pH. ברגע שזה מפסיק להבהב, לחץ על 'Enter'.
   6. שטוף את הבדיקה ומהכנס אותה לחיץ ההתייחסות השני. לאפשר את הערך לייצוב ולאחר מכן השתמש בלוח המקשים כדי להפוך את הערך מוצג תואם את ערך חיץ התייחסות הגבוה. לחץ על 'Enter' כדי לאשר.
   7. שטוף את הקצה החללית ונתק אותו מfermentor. שים את המכסה המגן על החיבור ולהתקין אותה בheadplate.
10. פתח את הקצה החללית ת.ד. ₂ ולבדוק כדי להבטיח שישמספיק אלקטרוליט כדי לכסות את הקצה. אם לא, להוסיף קצת למאגר ולסגור אותו בחזרה למעלה.
11. התקן את הבדיקה ת.ד. ₂ בheadplate ולוודא כי כובע החיטוי הוא לשים על כדי להגן על חיבורי החשמל שלה. זה יהיה מכויל לאחר עיקור.
12. השג בקבוק להזנה מגיב עם צינור לטבול ומסנן אוויר. הוספת צינורות משאבה ליציאת הצינור לטבול ולצרף את הקצה השני ליציאת כניסה על fermentor.
13. צינורות מקום בכל היציאות שאינן בשימוש ולאחר מכן מהדקים את צינורות.
14. להתקין מסנן 0.45 מיקרומטר בקבל גז הפליטה. מסנן זה מבטיח כי הכלי אינו לחצים בחיטוי.
15. בדוק שכל הצינורות שעוברים מתחת לרמה של התקשורת הם הידקו את אמצעי תקשורת כדי למנוע מלצאת.
16. שים את הכלי בחיטוי ל25-30 דקות ב121 ° C, מחזור נוזלי. זהירות: כשזה מגיע מתוך זה יהיה מאוד חם.
17. התקן את הכלי על בסיס fermentor.
18. לחבר את ה-pHבדיקה כבל.
19. חבר את כבל הבדיקה ת.ד. _2.
20. הוק sparger עד rotameter בנוסף גז.
21. Sterilely להוסיף 1 מגיב M NaOH לבקבוק עם הצינור לטבול ולהתקין את ראש המשאבה על ציר ראש משאבת בסיס.
22. שים את חיישן הטמפרטורה בthermowell על headplate. ודא שזה הולך כל הדרך עד לתחתית של thermowell.
23. מנמיכים את זרוע התסיסה על צימוד מאיץ כלי.
24. ודא כי fermentor הוא על.
25. בדוק שהמים זמינים לfermentor.
26. הפעל את אספקת האוויר לfermentor.
27. גלול לפרמטר הטמפרטורה ולהגדיר את הטמפרטורה ל 37 ° C. לחץ על הכפתור 'Enter' כדי להפעיל את בקרת הטמפרטורה. הכלי יהיה לחמם ב15 דקות או פחות.
28. הפעל את זרימת הגז ל1 כלי בנפח של המדיה לדקה או פחות. לשם כך הקימו, זרימת גז היא 3 ליטר / דקה. בועות אמורות להופיע בתחתית.
29. דפדף עד עמ 'התסיסהarameter ומוגדר 300 סל"ד. לחץ על 'Enter' כדי להפעיל את התסיסה.
30. ברגע שהגיעה לטמפרטורה 37 מעלות צלזיוס, גלול לפרמטר ה-pH ולהגדיר אותו 6.8. הפעל שליטת pH על ידי לחיצה על הכפתור 'Enter'.
31. הגדר תסיסה למהירות המרבית של 1,000 סל"ד לריצה.
32. ודא כי הבדיקה ת.ד. ₂ מקוטבת כראוי להצגת ערכים תקינים. לאחר 2 שעות, גלול לפרמטר ת.ד. ₂ ולהשתמש בלחצן 'התפריט' כדי לבחור את 'הפונקציה לכייל "ובחר את כיול נקודת 1.
33. לאחר 15 דקות, השתמש בסמנים כדי לקבוע את הערך ל100 ולחץ על Enter. זה לכייל ת.ד. _2.
34. גלול לתסיסה ומוגדרת 300 סל"ד.
35. שימוש בלחצן 'התפריט', להפוך את 'אשד' ל 'על' בתפריט התסיסה. זה יגביר את המהירות של תסיסה במאמץ לקצוץ את בועות אוויר ולהחדיר חמצן נוסף לפתרון עם עלייה בביקוש צמיחה.
36. גלול לפרמטר ת.ד. ₂ ולהגדיר את הערך ל30. לחץ על הכפתור 'Enter' כדי להתחיל ת.ד. _2.
37. הפעל את חבילת תוכנת השליטה במחשב.
38. לאחר הבדיקות מכוילות, החרדה היא יציבה ב300 סל"ד, טמפרטורה היא על 37 מעלות צלזיוס וpH קרוב ל6.8, זה זמן לחסן. שימוש באלכוהול, לעקר את היציאה שתשמש לחיסון.
39. צייר את הבידוד לתוך מזרק ולהוסיף אותו ליציאה המעוקרת. סגור את הנמל.
40. מציין את המועד לחיסון ביומן.
41. חשוב גם לקחת דגימה בזמן עיקור. לעקר את הקצה של צינור צינור הקציר עם אלכוהול.
42. פתח את המהדק המכסה את יציאת הקציר ולהשתמש במזרק לצייר מדגם. מדגם ראשון זה בדרך כלל מושלך משום שהיא כבר יושבת בצינור.
43. השתמש במזרק אחר כדי למשוך את מדגם אחר.
44. עם מזרק שלישי, דוחף את האוויר חזרה דרך הצינור להסיר כמה שיותר נפח מתמהקו ומהדק את הקו.
45. לקבוע את צפיפות התאים וה-pH ולהקליט את הערכים. עם תרבויות של חיידקים, הוא שימושי כדי להיכנס ערכים בכל שעה. המרווח הוא תלוי תרבות.
46. המתודולוגיה קציר תלויה בכוונות לתרבות לאחר הצמיחה הושלמה. במקרה זה, לטעום מהתרבות בפעם אחרונה כדי לקבל ערכי נקודת סיום לצפיפות תאים וה-pH או מדידה האפשרית של משקל תא רטוב. פתח את headplate מסולק מתוכן "טנק להרוג" מיועד עם אקונומיקה או סוכני מיקרוביאלית אחרים.

תוצאות

Bioreactor ניתן להפעיל עם או בלי תוכנת IRIS. עם זאת כדי ללכוד את הנתונים, עדיף להשתמש בתוכנה. לפני תוספת של חיידקים, חיישני pH והחמצן חייבים להיות מכוילים, סט מהירות המאיץ ולהגדיר הטמפרטורה. באיור 2, פלט נתונים לריצת bioreactor מוצג. הטמפרטורה הייתה מוגדרת 30 ° C, מהירות המאיץ ב200 סל"ד. הפרמטרים עשויים להיות שונים עבור כל ניסוי, אך לפני תוספת של חיידקים, המערכת צריכה להיות במצב יציב. באיור 3, השינוי בריכוז חמצן בתוספת תרבית החיידקים מוצג. הגדרת נקודות לצורך הניסוי הזה הן 37 מעלות צלזיוס, בוחש בסל"ד 200, O ₂ ב70%. בזמן 19:20, משאבת ההזנה מספקת את תרבות חיידקים בזרע OD של 0.1 גורם לרדת מייד בO ₂ הרמה. Bioreactor מגיב לשינוי O ₂ הרמה עם עלייה במהירות זרימת האוויר ומאיץ. Tהוא הגדרת נקודות לעליות נקבעות במפל (שלב 35). PH הכור היה פיקוח בזמן אמת, עם pH יורד אז הגדלת כפי שהודגם על ידי תנודות שורת pH לאורך זמן (איור 4). כל הריצה ניתן לנתח ופרמטרים מותאמים לניסויים הבאים.

איור 1. bioreactor המעבדתיים עם כל החלקים שכותרת ומחוברים. נתון זה מראה את כור הטנק עורר בתחילת ריצה. חלקיו של הכור מסומנים וכוללים חיישנים, גלגל מניע, מד טמפרטורה, בקבוקי הזנה ודגימה, יציאת פליטה, מד לחץ האוויר, ז'קט חימום, מגדל הקבל, ולוח בקרה.

איור 2. תמונת מסך של תוכנה עבור bioreactor tware בתחילת הריצה. בתחילת ריצת טנק עוררה, הטמפרטורה נקבעה ל 30 ° C (קו צהוב), מהירות מאיץ ב200 סל"ד (קו אדום), pH ב6.5 (קו ירוק), ות.ד. ₂ ב57.2% (קו כחול). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 3. תמונת מסך של תוכנת bioreactor במהלך הריצה כחמצן יורדת. כאשר התרבות היא בשלב צמיחה פעיל, היא צורכת חמצן וכמות החמצן בכור היא ירד (קו כחול). על ידי הגדלת מהירות המאיץ, יותר חמצן ניתן להוסיף לתרבות (קו אדום). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

gether.within-page = "תמיד">
איור 4. תמונת מסך של תוכנת bioreactor מראה שינוי pH לאורך זמן. pH של התרבות מנוטרת באופן רציף ולאורך זמן זה יורד ככל שהחומצה לקטית היא מיוצרת ולאחר מכן מגדיל את הבסיס מתווסף bioreactor (הקו כחול). לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה .

Discussion

bioreactors הטנק עורר הן הסטנדרט בתעשיית ביוטכנולוגיה והייתה בשימוש במשך 40 שנה ^1. הטנק הקטן עורר לא היה חשוב לסולם למעלה, בקנה מידה למטה, מתח אופטימיזציה, אפיון, ופיתוח בתהליך. גם זה יכול להיות תפקיד חשוב בהתפתחות של רפואה אישית ^2. Bioreactor בקנה מידה הקטנה הוא דומה ביותר לתנאים באתרו לצמיחת תאים, כי זה יכול להיות במעקב ואופטימיזציה בכל ריצה. לרוב, ניסויים ראשוניים מבוצעים תוך שימוש בבקבוקונים שייק אבל התנאים בbioreactor בקנה מידה הקטנה שונים באופן משמעותי מהבקבוק שייק. בניסוי אחד מצאנו כי התנאים לצמיחה אופטימלית של א ' coli והייצור של חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) בבקבוק לנער לא תרגמו לטנק בחש (נתונים שלא פורסמו).

שיטות אחרות של תאים גדל בקנה מידה גדולה כוללות בקבוקי רולר, u אחתse נדנדה bioreactors פלטפורמת ³ וbioreactors ליחד גדולה יותר עם ​​נפחי עבודה מ50 עד 5,000 ל 'לכל שיטה מספק אתגרים לסולם למעלה, אבל מצא את מקומה בייצור. ליחד הנדנדה bioreactor פלטפורמה דומה לטנק עורר, ומספק סביבה שפיקוח. זה שונה מהמכל עורר בערבוב המתרחשת תנועת נדנדה עקב ליצור גלים כדי למנוע התישבות תא ולספק חמצון. הידרודינמיקה לשיטה זו שונה מהטנק עורר ונפח מרבי מוגבל ל 1,000 ל 'ההבדלים יכולים להשפיע על צמיחת תאים וייצור מוצר. מערכות ליחד אחרות לשלב את טנק בחש עם הכור חד פעמי, לספק פלטפורמה עם מינימום של תשתיות ותקורה קשורות, ואת היכולת לתפוקה גבוהה bioprocessing ^4.

משתמשים חדשים של bioreactors המעבדתיים עלולים להתקשות בקביעת setpoints הראשוני עבור ה-pH, ת.ד. ₂ וTEMתנאי מזג אוויר, עם זאת, מחקר שפורסם יכול להיות בהפניה למידע זה ^{5, 6, 7, 8, 9.} עם תרבויות חיידקים בפרט, מומלץ להתחיל תסיסה באותה המהירות כמו הבקבוק שייקר ואת הטמפרטורה באותו setpoint. גם pH תרבות מריצות צלוחיות לרעוד קודמות יכול לשמש כנקודת התחלה. הגדרה של ערך ת.ד. ₂ היא קשה יותר, והוא בדרך כלל נקבע באופן אמפירי. עם זאת, עם תחילת 50% ת.ד. ₂ היא נקודת התחלה מומלצת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Catalog Number
LB broth	Sigma	L3022
ampicillin	Sigma	A1593-25G
LB broth	Sigma	L3022
antifoam 204	Sigma	A8311
1 M Sodium Hydroxide	Sigma	38215-1EA-R
Reference Buffer, pH 4.00	Sigma	B5020
Reference Buffer, pH 7.00	Sigma	B4770
pO2 probe electrolyte	Broadley James	AS-3140-C30-0025
0.45 micron filter	Cole Parmer	EW-02915-22
0.22 micron filter	Cole Parmer	EW-29950-40
Luer Lock syringe, 10 mL	Cole Parmer	EW-07940-12
Minifors Bioreactor	Infors HT	B-Pack 5.0
Air Admiral air pump	Cole Parmer	EW-79202-00
1175 PD Chilling circulator	VWR	13721-204