Эксплуатация настольной биореактора

Резюме

Ферментеры используются для повышения урожайности культуры и продуктивности биоинженерных клеток. После проверки нескольких микробных или животных кандидатов клеточных культур в колбах, следующим логическим шагом является увеличение биомассы от выбранной культуры с ферментер. Это видео демонстрирует настройку и работу типичной системе настольный биореактора.

Аннотация

Брожение системы используются для обеспечения оптимальных условий роста для многих различных типов клеточных культур. Возможность, предоставляемая ферментаторах тщательно контролировать температуру, рН и концентрации растворенного кислорода в частности делает их необходимо эффективного роста крупномасштабной и экспрессии продуктов брожения. Это видео будет кратко описать преимущества ферментер над вибрирующей колбе. Она также определит ключевые компоненты типичного настольного системы ферментации и дать базового обучения на установке судна и калибровки его зондов. Зритель будет ознакомился с процессом стерилизации и показали, как привить питательную среду в сосуде с культурой. Также будет продемонстрировано Основные понятия работы, отбора проб, и уборки урожая. Также будут обсуждаться Простой анализ данных и системы очистки.

Введение

Базовая технология ферментации является продолжением той простой встряски техники колбы для выращивания культур. Он вырос из желания контролировать среду роста для живых культур в более полной и количественно. Пакетные посеву колбы, как правило, ограничивается неточной контроля температуры. Однородность температуры в шейкер-инкубатор или теплом помещении сильно варьирует, иногда отклоняясь от 5 ° C или более от предполагаемого уставки. Поскольку вибрирующей колбе обычно перемешивают при фиксированной скорости, потребление кислорода и газообмен ограничено. Как только доступны окружающей среды кислород исчерпан, большинство культур не в состоянии процветать. Там нет никакого контроля рН в колбах. Во многих случаях, если культура не ограничивается сырья, становится кислым до точки ущерб культуре и дыхание резко замедляется. Большинство культур вибрирующей колбе также работать в качестве "партии", что означает, что они питаются только один раз на или вблизи начала культур inoculatioн. После этого первоначальный источник углерода потребляется, культура прекращает расти. В некоторых случаях его метаболизм может смещаться и начинают потреблять другие метаболиты в культуральном бульоне, иногда изменения характеристик полученного биомассы или белка. Колбах также обычно подлежат медиа потери испарения в теплых условиях культуры, как правило, 10% от объема, приходящегося на 24 часа при 37 ° С Эта потеря изменяет плотность культуры и запрещает длительный срок эксплуатации системы. Наконец, пользователь может столкнуться с пеной из средств массовой информации после агитации. Возникновение пены в приведенном выше культуре свободном пространстве будет ограничивать газообмен и дальнейший рост задушить.

Основная система ферментации предназначен для решения всех этих ограничений. Тщательный контроль температуры достигается в ферментационных сосудов с помощью крыльчатки перемешивания и нагревательной рубашкой. Датчик вставляется в емкость и обратной связи контроля нагрева и охлаждения этой куртке обычноРезультаты в температурного контроля ± 0,1 ° C вокруг уставки. Стационарные ферментеры как правило, обеспечивают контроль рН с помощью жидкостной того реагента через насос. Значение рН непрерывно контролируется в стремлении сохранить окружающую среду оптимальным для роста клеток. Правильное аэрации поддерживается вышеупомянутой смешивания рабочего колеса или с помощью инфузии воздух или кислород газа дополняться непосредственно в культуре. С сдвига чувствительных культур, кислород дополняется газ является основным механизмом для поддержания уровня кислорода в культуре. Измерение кислорода в растворе, как правило, достигается за счет полярографического зонда, который обычно не доступны для использования в колбах. Кроме того, можно непрерывно или периодически добавить канал в сосуд для поддержания роста в линейном или экспоненциальной форме. Выходящий газ конденсатор обеспечивает холодную поверхность для паров в потоке выхлопных газов для конденсации, таким образом, сохраняя объема культуры и плотность. Периодическое добавление противовспенивающего поверхностно приводитсяна датчик электропроводности в культуре, уменьшение пены на поверхности и позволяя газообмен.

Судно, со всеми зондами, фитинги, рабочие колеса, урожай трубы и трубки, собран и стерилизуют в стандартном автоклаве. После окончательного зонда калибровок и стабилизации к операционной среде, культура добавляется к судна. Затем система может быть использована, чтобы характеризовать культуру таким образом, что является более количественный и точным, чем с методом встряхивания флакона. Жесткий контроль температуры, рН, содержание кислорода, потребление корма, испарения жидкости и уровень пены способствуют гораздо более высокой биомассы и более высоким выходом белка.

протокол

1. Начните работу с установки судна. Обычный ферментер имеет следующие компоненты, которые должны быть установлены (рис. 1):
   1. рН зонд - для измерения рН в живой культуры. Калибровка зонда перед установкой и стерилизовать с судна. Установите зонд в Headplate.
   2. рО ₂ зонда - для измерения содержания растворенного кислорода внутри сосуда в процессе ферментации. Установите в Headplate.
   3. Урожай труба для отбора проб культуру. Установите это регулируемый компонент высоты в Headplate.
   4. Газ барботер - находится в нижней части сосуда и обеспечивает вливание газа в культуре. Крюк барботер до источника газа на ферментер и смонтировать в Headplate.
   5. Рабочее колесо вал и рабочее колесо - крыльчатка вызывает культуру и имеет решающее значение для поддержания культуры единообразия в сосуде.
   6. ОГ конденсатор - в пресечении потери за счет испарения в сосуде при охлаждении путь выхлопных газов.
   7. Реагент насосные линии для контроля рН или подачи того.
2. Очистите судно и Headplate водой с мылом. Мягкая щетка рекомендуется для чистки судно и Headplate. Bleach или очистители с хлором не может быть использован для очистки судна.
3. Если носитель не термолабильный, добавьте его в чистом сосуде. Только добавить до максимальный объем рабочего не будет достигнута. В этом случае максимальный рабочий объем составляет 3,3 л на 5 л общий объем судна.
4. Установите Headplate сосудов, гарантируя, что уплотнительное кольцо правильно установлен.
5. Установите конденсатор выхлопных газов.
6. Установите пеногаситель зонд в его 10 мм порт.
7. Установите урожая трубу в ее 10 мм порт. Положите кусок трубы на вершине ее и зажмите его.
8. Установите трубку и фильтр 0,20 мкм на входе промывной а затем зажать это от.
9. Калибровка рН электрод:
   1. Соберите 2 Ссылка буферы в небольших стаканах, бутылка мытья и запасной ваш стакан.
   2. Крюк рН зонда до ферментера и поверните ферментера на.
   3. Выделите параметра рН и с помощью кнопки меню, выделите опцию "CAL ', и нажмите" Enter ".
   4. Выберите '2 'для калибровки 2 точки.
   5. Смыть наконечник щупа и погрузите в низком базовом буфере. Значение на ферментер стабилизируется. Используя клавиши + и -, отрегулируйте значение на дисплее, чтобы соответствовать значению базового буфера рН. Как только он перестанет мигать, нажмите "Enter".
   6. Вымойте щуп с и вставить его в второй базового буфера. Разрешить значение для стабилизации и затем с помощью клавиатуры, чтобы отображаемое значение соответствует высокое значение буферной отсчета. Нажмите "Enter" для подтверждения.
   7. Промойте наконечник зонда и отсоедините его от ферментера. Положите защитный колпачок на связи и установить его в Headplate.
10. Откройте щуп РО ₂ и убедитесь, что тамдостаточно, чтобы покрыть электролит наконечник. Если нет, добавьте некоторые в резервуар и закрыть его обратно вверх.
11. Установите рО ₂ зонд в Headplate и убедитесь, что в автоклав крышка ставится на для защиты своих электрических соединений. Он будет откалиброван после стерилизации.
12. Получение бутылку для подачи реагента с погружной трубкой и воздушного фильтра. Добавить трубки насоса к порту погружной трубкой и прикрепите другой конец к входному отверстию на ферментер.
13. Место трубки на всех неиспользуемых портов, то зажим трубки выключен.
14. Установите фильтр 0,45 мкм на конденсаторе выхлопных газов. Этот фильтр обеспечивает то, что судно не оказывать давление в автоклаве.
15. Убедитесь, что все трубы, которые идут ниже уровня СМИ зажаты, чтобы предотвратить носитель из выходит.
16. Поместите сосуд в автоклаве в течение 25 - 30 мин при 121 ° С, жидкого цикла. Внимание: Когда дело доходит, что это будет очень жарко.
17. Установите сосуд на бродильного базы.
18. Подключите рНисследовать кабель.
19. Прикрепите зонд кабель рО _2.
20. Крюк Барботер по итогам газа сложения ротаметра.
21. Стерильно добавить 1 М NaOH реагента к бутылке с погружной трубкой и установить головку насоса на голову шпинделя база насоса.
22. Положите датчик температуры в защитной гильзы на Headplate. Убедитесь, что она идет все пути к дну гильзы.
23. Опустите агитационную руку на сосуды крыльчатки муфты.
24. Убедитесь, что ферментер включен.
25. Убедитесь, что вода доступна в ферментер.
26. Включите подачу воздуха в ферментер.
27. Выделите параметра температуры и установите температуру на 37 ° С Нажмите кнопку «Enter», чтобы начать контроль температуры. Судно будет нагреваться в 15 мин или меньше.
28. Включите подачу газа до 1 объемом емкости носителя в минуту или меньше. Для этого созданы, поток газа 3 л / мин. Пузыри должен появиться в нижней части.
29. Выделите агитационной рarameter и установить до 300 оборотов в минуту. Нажмите "Enter", чтобы включить агитации.
30. Как только температура достигла 37 ° С, выделите параметр рН и установить его на 6,8. Поверните регулятор рН, нажав на кнопку "Enter".
31. Установите агитацию к максимальной скоростью 1000 оборотов в минуту для бега.
32. Убедитесь, что _рО2 зонд поляризован правильно для правильного отображения значения. Через 2 часа, выделите параметр рО ₂ и использовать кнопку 'Menu', чтобы выбрать "Калибровка Function" и выберите калибровку 1 очко.
33. Через 15 мин, использовать курсоры для установки значения до 100 и нажмите «Enter». Это позволит откалибровать рО _2.
34. Выделите агитации и установить до 300 оборотов в минуту.
35. С помощью кнопки 'Menu', поверните 'Каскад', чтобы 'на' в меню агитации. Это позволит увеличить скорость агитации в попытке крошить пузырьки воздуха и заставить больше кислорода в растворе в виде увеличения спроса рост.
36. Выделите параметра рО ₂ и установите значение до 30. Нажмите кнопку «Enter», чтобы начать рО _2.
37. Запустите программный пакет управления на ПК.
38. После того, как зонды откалиброван, возбуждение стабилен при 300 оборотах в минуту, температура при 37 ° С и рН близка к 6,8, настало время для инокуляции. Прием алкоголя, стерилизовать порт, который будет использоваться для прививки.
39. Нарисуйте посевной в шприц и добавить его в стерилизованные порт. Закройте порт.
40. Отметить время прививки в журнале.
41. Важно также, чтобы взять пробу во время стерилизации. Стерилизовать конец сбора урожая трубы трубы с алкоголем.
42. Откройте зажим, закрывающую урожая порт и использовать шприц нарисовать образец. Этот первый образец обычно отбрасывают, так как он сидел в трубе.
43. Используйте другой шприц, чтобы вытащить другого образца.
44. С третьего шприца, толкать воздух обратно через трубу, чтобы удалить как можно больше мертвого объемаот линии и зажмите линию прочь.
45. Определение плотности клеток и рН и записать значения. С микробных культур, полезно для регистрации значений каждый час. Интервал культуры зависит.
46. Методология Урожай зависит от намерений к культуре после роста будет завершена. В этом случае образец культуре в последний раз на получение конечных значений плотности клеток и, возможно, рН или измерения веса влажной клеток. Откройте Headplate расположенный содержания в специально отведенном «убить танка» с отбеливателем или других противомикробных препаратов.

Результаты

Биореактор может работать с или без программного обеспечения IRIS. Однако для сбора данных, то лучше использовать программное обеспечение. Перед добавлением бактерий, рН и кислорода датчики должны быть откалиброваны, скорость набора рабочего колеса и заданной температуры. На рисунке 2, выходные данные для биореактора перспективе представлен. Температура была установлена ​​на 30 ° C, скорость крыльчатки при 200 оборотах в минуту. Параметры могут быть различными для каждого эксперимента, но перед добавлением бактерий, система должна быть в стабильном состоянии. На фиг.3, изменение концентрации кислорода с добавлением бактериальной культуры показано. Установочные значения для этого эксперимента 37 ° С, мешалку при 200 оборотах в минуту, O ₂ на 70%. Во время 19:20, подающий насос подает бактериальный посевной культуры на OD 0,1 вызывает сразу же падение уровня O _2. Биореактор отвечает на изменения O ₂ уровня с увеличением воздушного потока и рабочего колеса скорости. Тон уставки для увеличения устанавливаются в каскаде (шаг 35). Реактор рН мониторинг в реальном времени, с рН уменьшается, то увеличивается, о чем свидетельствует рН линии флуктуации во времени (рис. 4). Вся трасса могут быть проанализированы и параметры скорректированы с учетом последующих экспериментов.

Рисунок 1. Настольная биореактор со всеми частями меченых и связаны между собой. Эта цифра показывает реактор с мешалкой в начале пробега. Части реактора помечены и включают в себя датчики, рабочее колесо, датчик температуры, кормовые и отбора проб бутылки, выпускное отверстие, датчик давления воздуха, отопления куртку, конденсатор башню и панель управления.

Рисунок 2. Изображение на экране из биореактора Софtware в начале перспективе. В начале с мешалкой перспективе, температура была установлена ​​на уровне 30 ° C (желтая линия), скорость крыльчатки в 200 оборотов в минуту (красная линия), рН 6,5 (зеленая линия), и рО ₂ на 57,2% (синяя линия). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3. Изображение на экране из биореактора программного обеспечения во время бега как кислород уменьшается. Когда культура находится в активной фазе роста, он потребляет кислород и количество кислорода в реакторе уменьшается (синяя линия). Увеличивая скорость вращения крыльчатки, больше кислорода могут быть добавлены к культуре (красная линия). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 4. Изображение на экране из биореактора программного обеспечения, показывающий изменение рН с течением времени. The рН среды постоянно контролируется и с течением времени уменьшается, как молочная кислота производится, а затем увеличивается как основание добавляют в биореактор (синяя линия). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Обсуждение

Stirred биореакторы бак являются стандартным в биотехнологической отрасли и были использованы на протяжении более 40 лет ^1. Мешалкой Небольшой имело важное значение для МАСШТАБА, масштаб вниз, оптимизации деформации, описания, и процесс развития. Он также может играть важную роль в развитии индивидуального медицины ^2. Мелкий масштаб биореактор, наиболее похожий на месте условий для роста клеток, потому что это можно контролировать и оптимизированы на протяжении пробега. Чаще всего, первые эксперименты выполняются с использованием колбах, но условия в малых масштабах биореакторе значительно отличаться от встряхивания флаконов. В одном эксперименте мы обнаружили, что условия для оптимального роста E. палочка и производство зеленого флуоресцентного белка (GFP) в вибрирующей колбе не перевести на перемешивающего резервуара (неопубликованные данные).

Другие методы выращивания клеток в больших масштабах включают роликовые бутылки, один Uсебе качающейся платформе биореакторы ³ и более крупные биореакторы одноразового использования с рабочими объемами от 50 до 5000 L. Каждый метод обеспечивает вызовы для его увеличения, но нашел место в производстве. Одноразовый биореактор качающейся платформе аналогична перемешивающего резервуара, и обеспечивает регулируемую среду. Он отличается от перемешивающего резервуара в этой перемешивания происходит за счет качания движение генерировать волны для предотвращения клеток оседание и обеспечивают кислородом. Гидродинамика для этого метода отличаются от перемешивающего резервуара и максимальный объем ограничен 1000 L. Различия могут повлиять на рост клеток и производство продукта. Другие системы одноразового использования сочетать с мешалкой с одноразовой реактора, обеспечить платформу с минимумом инфраструктуры и связанных с ними издержек, а также возможность для высокой пропускной Bioprocessing ^4.

Новые пользователи настольных биореакторах могут иметь проблемы определения начальных уставки для рН, рО ₂ и температурахтемпературы, однако опубликованных исследований можно ссылаться на эту информацию ^{5, 6, 7, 8, 9.} С бактериальных культур, в частности, рекомендуется, чтобы начать перемешивание при той же скоростью, что и шейкер колбу и температуры, в то же заданного значения. Культура рН от предыдущих колбах трасс можно также использовать в качестве отправной точки. Установка значения рО ₂ является более трудным и, как правило, определены эмпирически. Однако, начиная с 50% рО ₂ является рекомендуемым отправной точкой.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth	Sigma	L3022
ampicillin	Sigma	A1593-25G
LB broth	Sigma	L3022
antifoam 204	Sigma	A8311
1 M Sodium Hydroxide	Sigma	38215-1EA-R
Reference Buffer, pH 4.00	Sigma	B5020
Reference Buffer, pH 7.00	Sigma	B4770
pO2 probe electrolyte	Broadley James	AS-3140-C30-0025
0.45 micron filter	Cole Parmer	EW-02915-22
0.22 micron filter	Cole Parmer	EW-29950-40
Luer Lock syringe, 10 mL	Cole Parmer	EW-07940-12
Minifors Bioreactor	Infors HT	B-Pack 5.0
Air Admiral air pump	Cole Parmer	EW-79202-00
1175 PD Chilling circulator	VWR	13721-204