שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

Summary

הנה, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בcytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח בתרבות. טכניקה זו יכולה לשמש כאלטרנטיבה לספירת CFU.

Abstract

מחקרים של מנגנוני פתוגנזה הסלולר של שמרים פתוגניים כגון קנדידה אלביקנס, capsulatum Histoplasma, וneoformans Cryptococcus להעסיק זיהום של מארחים יונקים או תאים מארחים (כלומר מקרופאגים) ואחריו כימות שמרים באמצעות מושבה להרכיב יחידת ניתוח או cytometry זרימה בדרך כלל. בעוד ספירת יחידת המושבה להרכיב כבר את השיטה הנפוצה ביותר בתחום, יש לו טכניקה זו חסרונות ומגבלות, כולל צמיחה איטית של כמה מיני פטריות על תקשורת מוצקה ויעילות ציפוי נמוכה ו / או משתנה, וזה מדאיג במיוחד כאשר משווה צמיחה של זני הבר מסוג והמוטציה. cytometry הזרימה יכול לספק מידע כמותי לגבי כדאיות שמרים מהיר, לעומת זאת, האימוץ של גילוי תזרים cytometric לשמרים פתוגניים היה מוגבל למספר סיבות מעשיות הכולל עלות הגבוהה שלה ושיקולי biosafety. הנה, אנחנו מדגימים מבוססי תמונההמתודולוגיה cytometric באמצעות חזון Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) לכימות של שמרים פתוגניים קיימא בשיתוף התרבות עם מקרופאגים. המחקרים שלנו להתמקד בזיהוי של שני פתוגנים פטרייתי אדם: capsulatum Histoplasma וקנדידה אלביקנס ח'. capsulatum colonizes מקרופאגים מכתשיים ידי שכפול בתוך phagosome מקרופאג, והנה, אנו כמותית להעריך את הצמיחה של ה שמרי capsulatum ב264.7 מקרופאגים RAW באמצעות acridine כתום / מכתים יודיד propidium בשילוב עם cytometry תמונה. השיטה שלנו בנאמנות מגמות צמיחה כפי שהיא נמדדת על ידי משחזרת מושבה מסורתית ויצרה ספירת יחידה, אבל עם רגישות מוגברת באופן משמעותי. בנוסף, אנו ישירות להעריך זיהום של מקרופאגים לחיות עם זן ה-GFP-לבטא של ג אלביקנס. המתודולוגיה שלנו מציעה אמצעי מהיר, מדויק וחסכוני לאיתור וכימות של פתוגנים פטרייתי אדם חשובים בשנינות העמותהתאי מארח h.

Introduction

מחקרים של פטריות פתוגניים בשיתוף עם המארחים ו / או תאי מארח שלהם לעתים קרובות דורשים כימות של תאים פטרייתיים קיימא לאורך זמן או כמובן בתנאי זיהום שונים. ספירה של יחידות מושבה להרכיב (CFU) היא השיטה הסטנדרטית שבו מספר התאים פטרייתיים קיימא כבר נמדד, לעומת זאת, טכניקה זו יש כמה חסרונות ומגבלות. ראשית, הרבה מיני פטריות הם בצמיחה איטית. צמיחה של מושבות גלויות על תקשורת מוצקה יכולה לקחת 1-2 שבועות, להאט את קצב המחקר באופן משמעותי. שנית, מניפולציה של דגימות במהלך ציפוי CFU היא תהליך מייגע, שכן כמה דילולים חייבים להיות מצופה על מנת להבטיח מספר מנייה של מושבות. שלישית, מספר CFU הוא בדרך כלל נמוך יותר ממספר אורגניזמים קיימא מצופים בגלל יעילות הציפוי היא גם מתחת ל -100%. לדוגמה, ביעילות ציפוי לcapsulatum Histoplasma הפתוגן פטרייתי דימורפית יכולה להיות גבוהה ככל 90%, אך באופן שגרתי הן נמוכות כמו30% והם נמוכים אף יותר (10%) לdimorph brasiliensis הקשור פטרייתי Paracoccidioides ^{1, 2.} ציפוי יעיל לקנדידה אלביקנס כפוף גם לשונות ^3. לבסוף, ניתוח CFU מהווה רק תאי חיים ופעילים המסוגלים חלוקת ביסוס צמיחה על תקשורת מוצקה, ואילו במצבים רבים, זה יהיה שימושי כדי לקבוע את הנוכחות והריכוז של תאים מתים שאינם פעילים ו / או חילוף חומרים.

בעבר, שיטות תזרים cytometric לכימות של כמה מיני פטריות פתוגניים תוארה ^4-6. עם זאת, בשל בעיות בלימת biosafety מעורבות עם השימוש בפתוגנים BSL3 ברמת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL2) או על cytometers זרימה משותף, האימוץ של טכניקה זו היה מוגבל. כמו cytometry הזרימה, cytometry התמונה הוא שיטה רגישה ומהירה של תא כימות. עם זאת, ניתן לבצע cytometry תמונה בכל חלק של העלות עם תוצאות דומות ^{7 -}11. כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע cytometry תמונה של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח. אנו מדגימים את השיטות שלנו באמצעות שני פתוגנים פטרייתי אדם: capsulatum Histoplasma וקנדידה אלביקנס ח'. capsulatum הוא פתוגן פטרייתי דימורפית שגורם למחלות בדרכי הנשימה, בבני אדם, שהוא גדל שמרי ניצנים וכמשכפל בתוך מקרופאגים מכתשיים קנדידה אלביקנס הוא מין commensal אדם שלעתים גורם לקנדידה.. אנו מראים כי cytometry התמונה מאפשרת כימות מהירה של שמרים אלה, יחד עם יכולת הדמיה.

Protocol

1. זיהום של המקרופאגים עם ח' capsulatum, ג אלביקנס

1. 16 שעות לפני ההדבקה, מקרופאגים זרעים בצפיפות רצויה ב24 גם צלחות. בפרוטוקול זה, צפיפות של 3.0 x 10 ⁵ תאים / גם הייתה בשימוש.
2. הוסף תאים פטרייתיים בצמיחת יומן שלב בריבוי רצוי של זיהום (משרד הפנים). פרוטוקול זה יכול להכיל מגוון של משרד הפנים (0.2-5.0). להדבקת RAW264.7 מקרופאגים עם ח' capsulatum, השתמשנו במשרד פנים של 0.2.
3. בעקבות 1.5 שעות כדי לאפשר לphagocytosis, לשטוף מקרופאגים שלוש פעמים עם PBS להסיר פטריות תאית.
4. דגירה של מספר רצוי של שעות לפני ניתוח מדגם. במשרד פנים נמוך (0.2 בניסוי שלנו), תאי macrophage נגועים להישאר קיימא במשך כמה ימים, וניתן לנתח דגימות בערך כל 12-24 שעות.

2. תמוגה מקרופאג

1. לשחרר את פטריות מתאי macrophage, להסיר תקשורת, לשטוף 3 פעמים עם PBS, ולהוסיף 0.5 מיליליטר מים סטריליים. בתנאים אלה, יהיו lyse מקרופאגים ותאי פטריות יישארו ללא שינוי.
2. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
3. העבר lysate לצינור סטרילי, לשמור על קרח.
4. העבר את 20 lysate μl לצינור נפרד, ולאחר מכן להוסיף פתרון PI 20 AO / μl. להמשיך ישירות לשלב 5: "לדוגמא הכנה לניתוח cytometric תמונה"

3. ציפוי CFU

1. לבצע דילול של פי עשרה מlysates (משלב 2.3) בתקשורת.
2. צלחת μl 100 של דילול כל, בשני עותקים, על צלחות HMM-agarose. דגירה צלחות בתא humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _{2 למשך} 7-8 ימים.
3. לספור ידני מושבות על צלחות מוצגות מינימום של 100 ועד למקסימום של 1,000 מושבות נפרדות.

4. ויזואליזציה של פטריות בתוך המקרופאגים חיים

1. לאסוף מקרופאגים חיים, לשטוף תאים 3 פעמים עם PBS. הוסף 0.5 מ"ל PBS ו דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C.
2. כדי להסיר מקרופאגים מבארות תרבית רקמה, בעדינות פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים. העבר את הנוזל לצינור סטרילי, לשמור על קרח.
3. העבר את 20 מדגם μl לצינור נפרד, ולאחר מכן להוסיף פתרון PI 20 AO / μl. להמשיך ישירות לשלב 5: "לדוגמא הכנה לניתוח cytometric תמונה".

5. לדוגמא הכנה לניתוח cytometric תמונה

1. פיפטה מדגם היעד ביסודיות ולאחר מכן להעביר 20 μl של דגימה לתוך תא ספירת תאים חד פעמי.
2. אפשר התאים להתיישב בחדר למשך 30 שניות.
3. הכנס לספור קאמרית לcytometer התמונה.

6. התקנת מכשיר Cellometer

1. הכנס את מודולים אופטיים הקרינה: VB-535-402 ו-VB-660-502 למערכת ולוודא שהם נעולים במקום.
   1. VB-535-402 (עירור ב 475 ננומטר, פליטה ב 535 ננומטר) משמש לacridine כתום וגילוי ה-GFP.
   2. VB-660-502 (excitatiב540 ננומטר, פליטה ב 660 ננומטר) משמשת לזיהוי יודיד propidium.
2. הפעל cytometer התמונה ולפתוח את התוכנה הנלווית.

7. התקנת תוכנת Cellometer

1. בחר את "סוג assay" הקבוע מראש ו" סוג סלולרי "בתפריט הנפתח Assay.
   1. לכדאיות, assay הוא מותאם לacridine כתום וזיהוי יודיד propidium.
   2. לצורך זיהוי של זיהום קנדידה אלביקנס, assay מתוכנן לגילוי ה-GFP.
2. בחר "אפשרויות" בחלק העליון ולחץ על "תמונת רקע לקחת", ולאפשר את הפעולה כדי להשלים.
3. לחץ על "תמונה בהירה שדה תצוגה מקדימה".

8. הליך רכישת תמונה

1. הכנס את המדגם קאמרי המוכן לcytometer התמונה.
2. השתמש בכפתור הפוקוס ולהתאים את הפוקוס.
3. פעם אחת בפוקוס, לחץ על "רוזן", ולאפשר את פעולת רכישת התמונה כדי להשלים.
4. רמוve חדר ספירה חד פעמי ולהשליך כראוי.

9. ניתוח נתוני תמונה

1. ריכוז ומדידת כדאיות
   1. ברגע שהספירה הושלמה, הריכוז ויכולת הקיום של תאי המטרה מוצגים בדף התוצאות.
   2. לחץ על "יצוא" כדי לייצא את הנתונים לFCS Express 4 לניתוח אוכלוסיית תאי ה-GFP בניסוי זיהום קנדידה אלביקנס.
2. ניתוח FCS אקספרס של תאים נגועים בקנדידה אלביקנס
   1. לייבא את קובץ ". NXDAT" לFCS Express 4 ועלילה את התוצאות ביסטוגרמה פלואורסצנטי.
   2. החל שער אוכלוסיית תא ליסטוגרמה כדי לקבוע את אחוזי האוכלוסייה של תאים נגועים בקנדידה אלביקנס.

תוצאות

אנחנו השתמשנו cytometer תמונת חזון Cellometer לפקח צמיחה של ה capsulatum בתאי macrophage. 264.7 תאי RAW היו נגועים בח' תאי שמרי capsulatum ובנקודות זמן שונים, דגימות היו נתונים לצביעת AO / PI ואחרי ניתוח cytometric מבוסס תמונה. במקביל, דגימות נותחו על ידי ספירת CFU מסורתית. בכל נקודת זמן, דג...

Discussion

cytometry התמונה מאפשרת למשתמש ללכוד תמונות באיכות גבוהות, ובאמצעות תוכנה מיוחדת, לבצע כימות מהירה של תאים. אתגר אחד פוטנציאל לאימוץ cytometry תמונה בתחום פתוגנזה של חיידקים הוא שהחיידקים שנספרו נמצאים באוכלוסייה מעורבת של תאים, כולל תאי מארח יונקים. כאן, אנו מראים כי cytometry ת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM	Life Technologies	11965-084
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
AO/PI Solution	Nexcelom Bioscience	CSK-0102
Disposable Counting Chamber	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100
EQUIPMENT
Cellometer Vision	Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision Software	Nexcelom Bioscience