Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, wie Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen in der Kultur verwendet werden. Diese Technik kann als Alternative zu CFU Aufzählung verwendet werden.

Zusammenfassung

Untersuchungen der zellulären Pathogenese pathogener Hefen wie Candida albicans, Histoplasma capsulatum und Cryptococcus neoformans verwenden üblicherweise Infektion von Säugetier-Hosts oder Wirtszellen (zB Makrophagen) durch Hefe Quantifizierung mittels koloniebildende Einheit Analyse oder Durchflusszytometrie gefolgt. Während koloniebildende Einheit Aufzählung ist das am häufigsten verwendete Verfahren auf dem Gebiet hat diese Technik Nachteile und Beschränkungen, einschließlich der langsamen Wachstum einiger Pilzarten auf festen Medien und nieder-und / oder variable Beschichtung Wirkungsgrade, die von besonderer Bedeutung ist bei einem Vergleich Wachstum von Wildtyp-und Mutanten. Durchflusszytometrie können schnelle quantitative Informationen über Hefelebensfähigkeit bieten hat jedoch Verabschiedung durchflusszytometrischen Nachweis für pathogene Hefen für eine Reihe von praktischen Gründen, einschließlich seiner hohen Kosten und die biologische Sicherheit Überlegungen beschränkt. Hier zeigen wir eine bildbasiertecytometric Methodik mit der Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) für die Quantifizierung von lebensfähigen pathogenen Hefen in Co-Kultur mit Makrophagen. Histoplasma capsulatum und Candida albicans H.:. Unsere Studien auf dem Nachweis von zwei menschlichen Pilzpathogene konzentrieren capsulatum kolonisiert Alveolarmakrophagen durch die Replikation innerhalb der Makrophagen phagosome, und hier haben wir quantitativ das Wachstum von H. capsulatum Hefen in RAW 264.7 Makrophagen mit Acridinorange / Propidiumiodidfärbung in Kombination mit Bildzytometrie. Unsere Methode treu rekapituliert Wachstumstrends wie durch traditionelle Kolonie bildende Einheit Aufzählung gemessen, aber mit deutlich erhöhter Empfindlichkeit. Zusätzlich haben wir direkt beurteilen Infektion von lebenden Makrophagen mit einem GFP-exprimierenden Stamm von C. albicans. Unsere Methodik bietet eine schnelle, genaue und kostengünstige Mittel zur Detektion und Quantifizierung von wichtigen menschlichen pilzliche Erreger in Verbindung with Wirtszellen.

Einleitung

Studien von pathogenen Pilzen in Verbindung mit ihren Gastgebern und / oder Wirtszellen erfordern oft Quantifizierung der lebensfähigen Pilzzellen über einen Zeitverlauf oder unter verschiedenen Bedingungen Infektion. Zählung der koloniebildenden Einheiten (CFU) der Standard-Methode, durch die die Zahl der lebensfähigen Pilzzellen gemessen wurde, jedoch hat dieses Verfahren einige Nachteile und Einschränkungen. Erstens sind viele Pilzarten langsam wachsende. Das Wachstum der sichtbaren Kolonien auf festen Medien kann 1-2 Wochen, deutlich verlangsamt das Tempo der Forschung. Zweitens ist Manipulation von Proben während der CFU Beschichtung ein langwieriger Prozess, da mehrere Verdünnungen müssen beschichtet, um eine zählbare Anzahl der Kolonien zu gewährleisten. Drittens, ist die Anzahl der CFU typischerweise geringer als die Zahl von lebensfähigen Organismen, weil die Beschichtung überzogen Wirkungsgrad deutlich unter 100%. Zum Beispiel kann Plattieren Wirkungsgrade für die dimorphic Pilzpathogen Histoplasma capsulatum so hoch wie 90%, aber routinemäßig so niedrig wie30% und sogar noch niedriger (10%) für die entsprechende Pilz dimorph Paracoccidioides brasiliensis ^{1, 2.} Plating Effizienz für Candida albicans ist auch Gegenstand Variabilität ^3. Schließlich entfallen CFU Analyse für nur leben und sich aktiv teilenden Zellen, die zur Festlegung Wachstum auf festen Medien, wobei in vielen Situationen, wäre es nützlich, um die Anwesenheit und Konzentration von toten und / oder metabolisch inaktiven Zellen zu bestimmen.

Zuvor hat durchflusszytometrischen Methoden zur Quantifizierung von mehreren pathogenen Pilzarten wurden ^4-6 beschrieben. Doch aufgrund Biosicherheit Containment Probleme bei der Verwendung Sicherheitsstufe 2 (BSL2) oder BSL3-Level Krankheitserreger auf gemeinsamen Durchflusszytometern beteiligt hat Annahme dieser Technik beschränkt. Wie Durchflusszytometrie ist Bildzytometrie eine sensible und schnelle Methode der Zelle Quantifizierung. Allerdings kann Bildzytometrie zu einem Bruchteil der Kosten mit vergleichbaren Ergebnissen ⁷ durchgeführt werden ^-11. Hier beschreiben wir Verfahren zur Durchführung Bildzytometrie von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen. Wir demonstrieren unsere Methoden mit zwei menschlichen Pilzpathogene: Histoplasma capsulatum und Candida albicans H.. capsulatum ist ein dimorphic Pilzpathogen, die Erkrankung der Atemwege verursacht, in den Menschen, es wächst wie Bäckerhefe und repliziert in Alveolarmakrophagen Candida albicans ist ein Mensch kommensalen Arten, die gelegentlich verursacht Candidiasis.. Wir zeigen, dass Bildzytometrie schnelle Quantifizierung dieser Hefen ermöglicht, zusammen mit Visualisierungsmöglichkeiten.

Protokoll

1. Die Infektion von Makrophagen mit H. capsulatum, C. albicans

1. 16 Stunden vor der Infektion, Samen Makrophagen an gewünschten Dichte in 24-Well-Platten. In diesem Protokoll wurde eine Dichte von 3,0 x 10 ⁵ Zellen / Vertiefung verwendet.
2. In Pilzzellen in log-Wachstumsphase bei einer gewünschten Multiplizität der Infektion (MOI). Dieses Protokoll bietet Platz für eine Reihe von MOI (0,2-5,0). Für die Infektion von Makrophagen mit RAW264.7 H. capsulatum, verwendeten wir eine MOI von 0,2.
3. Nach 1,5 Stunden für Phagozytose erlauben, waschen Makrophagen dreimal mit PBS an extrazelluläre Pilze zu entfernen.
4. Inkubieren gewünschte Anzahl von Stunden vor Probenanalyse. Bei niedrigen MOI (0.2 in unserem Experiment), bleiben infizierten Makrophagen für mehrere Tage lebensfähig, und die Proben können etwa alle 12-24 Stunden analysiert werden.

2. Makrophagen Lysis

1. Um Pilze aus Makrophagen befreien, entfernen Medien, 3 x waschen mit PBS, und0,5 ml sterilem Wasser. Unter diesen Bedingungen wird Makrophagen lysieren und Pilzzellen bleiben erhalten.
2. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur gerührt.
3. Übertragen Lysat sterilen Röhrchen, halten auf dem Eis.
4. Übertragen Sie 20 ul Lysat zu einem separaten Röhrchen, dann fügen Sie 20 ul AO / PI-Lösung. Gehen Sie direkt zu Schritt 5: "Probenvorbereitung für Bild Cytometric Analysis"

3. CFU Plating

1. Führen zehnfache Verdünnung der Lysate (aus Schritt 2.3) in den Medien.
2. Platte 100 ul jeder Verdünnung in zweifacher Ausfertigung auf HMM-Agaroseplatten. Die Platten in einer feuchten Kammer bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 7-8 Tage.
3. Manuelles zählen Kolonien auf Platten Darstellung von mindestens 100 und maximal 1000 verschiedene Kolonien.

4. Visualization of Fungi innerhalb Live-Makrophagen

1. Um Live-Makrophagen sammeln, waschen Sie die Zellen 3 mal mit PBS. 0,5 ml PBS und Inkubation für 30 min bei 4 ° C.
2. Um Makrophagen aus Gewebekulturvertiefungen entfernen, sanft und Abpipettieren mehrmals. Übertragen Flüssigkeit sterilen Röhrchen, halten auf dem Eis.
3. Übertragen Sie 20 ul Probe auf einem separaten Röhrchen, dann fügen Sie 20 ul AO / PI-Lösung. Gehen Sie direkt zu Schritt 5: "Probenvorbereitung für Bild Cytometric Analysis".

5. Probenvorbereitung für Bild Cytometric Analysis

1. Pipettieren Sie die Target-Probe gründlich und übertragen dann 20 ul Probe in die Zelle Einweg-Zählkammer.
2. Lassen Sie die Zellen in der Kammer für 30 Sekunden absetzen.
3. Legen Zählkammer in das Bild cytometer.

6. Cellometer Instrument Setup

1. Legen Sie die Fluoreszenzoptik Module: VB-535 bis 402 und VB-660 bis 502 in das System und sicherstellen, dass sie an Ort und Stelle sind gesperrt.
   1. VB-535 bis 402 (Anregung bei 475 nm, Emission bei 535 nm) ist für Acridinorange und GFP-Erkennung verwendet.
   2. VB-660 bis 502 (excitatiauf bei 540 nm wird die Emission bei 660 nm) für Propidiumiodid Detektion verwendet.
2. Schalten Sie auf das Bild cytometer und öffnen die zugehörige Software.

7. Cellometer Software Setup

1. Wählen Sie die Vorgabe "Assay Type" und "Cell Type" in der Assay Dropdown-Menü.
   1. Für Lebensfähigkeit wird der Assay für Acridinorange und Propidiumiodid Erkennung optimiert.
   2. Für den Nachweis von Candida albicans-Infektion wird der Assay für GFP Erkennung optimiert.
2. Wählen Sie "Optionen" auf der Oberseite und klicken Sie auf "Take Background Image", und lassen Sie den Vorgang abgeschlossen ist.
3. Klicken Sie auf "Vorschau Hellfeldbild".

8. Image Acquisition Vorgehensweise

1. Legen Sie die vorbereiteten Probe Kammer in das Bild cytometer.
2. Verwenden Sie den Fokus Knopf und stellen Sie den Fokus.
3. Einmal im Fokus, auf "Count" klicken, und lassen Sie die Bildaufnahme Vorgang abgeschlossen ist.
4. Remove die Einweg-Zählkammer und entsorgen.

9. Bild Datenanalyse

1. Konzentration und Lebensfähigkeit Messung
   1. Sobald die Zählung abgeschlossen ist, werden die Konzentration und die Lebensfähigkeit der Zielzellen in der Ergebnis-Seite angezeigt.
   2. Klicken Sie auf "Export", um die Daten in FCS Express 4 exportieren für Zellpopulation Analyse der GFP in der Candida albicans-Infektion Experiment.
2. FCS Express Analyse von Candida albicans-infizierten Zellen
   1. Importieren Sie die ". NXDAT" Datei in FCS Express 4 und dann das Ergebnis in einem Fluoreszenz-Histogramm.
   2. Bewerben Zellpopulation Tor zum Histogramm, um die Bevölkerung Prozentsätze der Candida albicans-infizierten Zellen zu bestimmen.

Ergebnisse

Wir nutzten die Cellometer Bild Anblick cytometer um das Wachstum von H. überwachen capsulatum in Makrophagen. RAW 264.7 Zellen wurden mit H. infiziert capsulatum Hefezellen und zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben AO / PI-Färbung von bildbasierten durchflusszytometrische Analyse, unterzogen. Parallel dazu wurden Proben von traditionellen CFU Aufzählung analysiert. Zu jedem Zeitpunkt wurden die Proben in Wasser inkubiert, um Makrophagen zu lysieren und die freigesetzte Hefeze...

Diskussion

Bildzytometrie ermöglicht es dem Benutzer, um qualitativ hochwertige Bilder zu erfassen und mit spezieller Software, führen Sie eine schnelle Quantifizierung von Zellen. Eine mögliche Herausforderung für die Annahme Bildzytometrie im Bereich der mikrobiellen Pathogenese ist, dass die Mikroorganismen zu zählen, die in einer gemischten Population von Zellen, einschließlich Säuger-Wirtszellen sind. Hier zeigen wir, dass Bildzytometrie zur Quantifizierung von lebensfähigen pathogenen Hefen während der in vitro-...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM	Life Technologies	11965-084
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
AO/PI Solution	Nexcelom Bioscience	CSK-0102
Disposable Counting Chamber	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100
EQUIPMENT
Cellometer Vision	Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision Software	Nexcelom Bioscience