L'uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

Riepilogo

Qui mostriamo come citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti in coltura. Questa tecnica può essere utilizzata come alternativa al CFU enumerazione.

Abstract

Studi dei meccanismi di patogenesi cellulari di lieviti patogeni come la Candida albicans, capsulatum Histoplasma e Cryptococcus neoformans comunemente impiegano infezione di ospiti mammiferi o cellule ospitante (cioè macrofagi) seguita da quantificazione lievito utilizzando formanti colonie analisi unità o citometria a flusso. Mentre unità formanti colonia enumerazione è stato il metodo più comunemente utilizzato in campo, questa tecnica ha degli svantaggi e limitazioni, tra cui lenta crescita di alcune specie fungine su supporti solidi ed efficienze basse e / o variabile placcatura, il che è di particolare interesse quando si confrontano crescita di ceppi wild-type e mutanti. Citometria di flusso può fornire informazioni quantitative relative rapida vitalità del lievito, tuttavia, adozione mediante citometria a flusso per lieviti patogeni è stato limitato per una serie di ragioni pratiche tra cui il suo biosicurezza considerazioni costo elevato e. Qui, dimostriamo una immagine basata sumetodologia citometria utilizzando la Vision Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) per la quantificazione dei lieviti patogeni vitali in co-coltura con macrofagi. I nostri studi si concentrano sulla individuazione di due funghi patogeni umani: capsulatum Histoplasma e Candida albicans H.. capsulatum colonizza macrofagi alveolari replicando all'interno del phagosome macrofagi, e qui, abbiamo quantitativamente valutare la crescita di H. lieviti capsulatum in macrofagi RAW 264.7 con arancio di acridina / ioduro di propidio colorazione in combinazione con citometria immagine. Il nostro metodo fedelmente ricapitola i trend di crescita, misurata dalla colonia tradizionale formando unità di enumerazione, ma di un significativo aumento della sensibilità. Inoltre, valutiamo direttamente infezione di macrofagi in diretta con un ceppo GFP che esprimono di C. albicans. La nostra metodologia offre un mezzo rapido, preciso ed economico per il rilevamento e la quantificazione di importanti funghi patogeni umani in associazione spiritocellule ospiti h.

Introduzione

Studi di funghi patogeni, in associazione con i loro ospiti e / o le cellule ospiti richiedono spesso quantificazione delle cellule fungine vitali corso di un corso di tempo o in diverse condizioni di infezione. Enumerazione di unità formanti colonie (CFU) è il metodo standard con cui è stato misurato il numero di cellule vitali fungine, tuttavia, questa tecnica presenta diversi inconvenienti e limitazioni. In primo luogo, molte specie fungine sono a crescita lenta. La crescita di colonie visibili su terreni solidi può richiedere 1-2 settimane, rallentando notevolmente il ritmo della ricerca. Secondo, manipolazione dei campioni durante CFU placcatura è un processo laborioso, da alcuni diluizioni devono essere placcati per assicurare un numero numerabile di colonie. Terzo, il numero di CFU è tipicamente inferiore al numero di organismi vitali piastrate poiché il rendimento placcatura è ben inferiore al 100%. Ad esempio, l'efficienza di placcatura per il dimorfismo fungino agente patogeno capsulatum Histoplasma può essere alto come il 90%, ma sono di routine a partire da30% e sono ancora più basso (10%) per il relativo fungina dimorph Paracoccidioides brasiliensis ^{1, 2.} Efficienza placcatura per la Candida albicans è soggetto a variabilità ^3. Infine, l'analisi CFU rappresenta solo cellule vive e dividendo attivamente capaci di instaurare crescita su terreno solido, mentre in molti casi, sarebbe utile per determinare la presenza e la concentrazione di cellule inattive morte e / o metabolicamente.

In precedenza, i metodi di citometria a flusso per la quantificazione dei vari patogeni specie fungine è stata descritta ^4-6. Tuttavia, a causa di problemi di contenimento biosicurezza coinvolti utilizzando il livello di biosicurezza 2 (BSL2) o patogeni BSL3 livello sul citofluorimetri condivisi, l'adozione di questa tecnica è stato limitato. Come la citometria a flusso, citometria immagine è un metodo sensibile e rapido di quantificazione delle cellule. Tuttavia, citometria immagine può essere eseguita ad una frazione del costo con risultati paragonabili ^{7 -}11. Qui, descriviamo i metodi per l'esecuzione di citometria a immagine di funghi patogeni in associazione con cellule ospiti. Dimostriamo nostri metodi che utilizzano due funghi patogeni umani: capsulatum Histoplasma e Candida albicans H.. capsulatum è un patogeno fungino dimorphic che causa la malattia respiratoria, negli esseri umani, cresce come lievito in erba e si replica all'interno di macrofagi alveolari Candida albicans è una specie commensali umani che causano occasionalmente candidosi.. Abbiamo dimostrato che la citometria a immagine consente una rapida quantificazione di questi lieviti, insieme con la capacità di visualizzazione.

Protocollo

1. L'infezione dei macrofagi con H. capsulatum, C. albicans

1. 16 ore prima dell'infezione, macrofagi sementi alla densità desiderata in piastre da 24 pozzetti. In questo protocollo, è stata utilizzata una densità di 3,0 x 10 ⁵ cellule / pozzetto.
2. Aggiungi cellule fungine in fase di crescita logaritmica ad una molteplicità desiderato di infezione (MOI). Questo protocollo può accogliere una gamma di MOI (0,2-5,0). Per l'infezione di macrofagi RAW264.7 con H. capsulatum, abbiamo utilizzato un MOI di 0,2.
3. Seguendo 1,5 ore per permettere la fagocitosi, i macrofagi lavare tre volte con PBS per rimuovere funghi extracellulari.
4. Incubare per numero desiderato di ore prima dell'analisi del campione. A partire MOI (0,2 nel nostro esperimento), cellule di macrofagi infettati rimangono vitali per diversi giorni, ed i campioni possono essere analizzati circa ogni 12-24 hr.

2. Macrofago Lysis

1. Per liberare i funghi da macrofagi, rimuovere i supporti, lavare 3 volte con PBS, eaggiungere 0,5 ml di acqua sterile. In queste condizioni, i macrofagi e lisare cellule fungine rimarranno intatti.
2. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Trasferimento lisato di provetta sterile, tenere in ghiaccio.
4. Trasferire 20 microlitri di lisato un tubo separato, quindi aggiungere 20 microlitri AO / soluzione di PI. Passare direttamente al punto 5: "Preparazione del campione per analisi di citometria immagine"

3. CFU placcatura

1. Eseguire dieci volte diluizione dei lisati (dal punto 2.3) in media.
2. Tavola 100 ml di ogni diluizione, in duplice copia, su piastre HMM-agarosio. Incubare le piastre in una camera umidificata a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 7-8 giorni.
3. Contare manualmente le colonie su piastre di visualizzazione di un minimo di 100 e un massimo di 1.000 colonie distinte.

4. Visualizzazione dei funghi all'interno dei macrofagi in diretta

1. Per raccogliere i macrofagi vivo, lavare le cellule 3 volte con PBS. Aggiungere 0,5 ml di PBS e incubare per 30 min a 4 ° C.
2. Per rimuovere i macrofagi da pozzetti di coltura dei tessuti, pipettare delicatamente su e giù parecchie volte. Trasferimento liquido provetta sterile, tenere in ghiaccio.
3. Trasferire 20 ml del campione in una provetta separata, quindi aggiungere 20 microlitri AO / soluzione di PI. Passare direttamente al punto 5: "Preparazione del campione per analisi di citometria immagine".

5. Preparazione del campione per l'analisi di citometria Immagine

1. Pipettare accuratamente il campione di riferimento e quindi trasferire 20 ml di campione nella camera di conta cellulare usa e getta.
2. Permettono alle cellule di stabilirsi nella camera per 30 sec.
3. Inserire il conteggio da camera nel citometro immagine.

6. Configurazione strumento Cellometer

1. Inserire l'ottica di fluorescenza Moduli: VB-535-402 e VB-660-502 nel sistema e fare in modo che siano bloccati in posizione.
   1. VB-535-402 (eccitazione a 475 nm, emissione a 535 nm) è utilizzato per il rilevamento e arancio acridina GFP.
   2. VB-660-502 (excitation a 540 nm, emissione a 660 nm) è utilizzato per il rilevamento ioduro di propidio.
2. Accendere il citometro immagine e aprire il software di accompagnamento.

7. Software Setup Cellometer

1. Selezionare il preset "Reazione" e "Tipo di cella" nel menu a scomparsa del saggio.
   1. Per la viabilità, il saggio è ottimizzato per arancio di acridina e la rilevazione ioduro di propidio.
   2. Per il rilevamento di infezione da Candida albicans, il saggio è ottimizzato per il rilevamento GFP.
2. Selezionare "Opzioni" nella parte superiore e fare clic su "Sfondo prendere l'immagine", e consentire il completamento dell'operazione.
3. Fare clic su "Anteprima Bright-Campo di immagine".

8. Acquisizione di immagini di Procedura

1. Inserire la camera del campione preparato nel citometro immagine.
2. Utilizzare la manopola di messa a fuoco e regolare la messa a fuoco.
3. Una volta a fuoco, fare clic su "Conte", e consentire l'operazione di acquisizione di immagini da completare.
4. Remove la camera di conteggio monouso e smaltire in modo appropriato.

9. Immagine Data Analysis

1. La concentrazione e la misurazione della vitalità
   1. Una volta che il conteggio è completato, la concentrazione e la vitalità delle cellule bersaglio vengono visualizzati nella pagina di risultato.
   2. Fare clic su "Esporta" per esportare i dati in FCS Express 4 per l'analisi popolazione di cellule GFP nel esperimento infezione da Candida albicans.
2. FCS analisi express di Candida albicans cellule infette
   1. Importare il file ". NXDAT" in FCS Express 4 e riportare i risultati in un istogramma di fluorescenza.
   2. Applicare cancello popolazione cellulare per l'istogramma per determinare le percentuali di popolazione di Candida albicans cellule infette.

Risultati

Abbiamo usato il Cellometer Vision immagine citometro a monitorare la crescita di H. capsulatum in macrofagi. 264.7 cellule RAW sono state infettate con H. cellule di lievito capsulatum e in vari momenti, i campioni sono stati sottoposti ad AO / PI colorazione seguita da analisi di citometria basata sulle immagini. In parallelo, i campioni sono stati analizzati con tradizionale enumerazione CFU. Ad ogni tempo, i campioni sono stati incubati in acqua per lisare macrofagi e le cellule di lievito...

Discussione

Citometria a immagine consente di catturare immagini di alta qualità e, utilizzando software specializzati, eseguire una rapida quantificazione delle cellule. Una sfida potenziale all'adozione di citometria immagine nel campo della patogenesi microbica è che sono presenti in una popolazione mista di cellule, comprese le cellule ospiti di mammifero i microbi da contare. Qui, dimostriamo che citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei lieviti patogeni vitali durante l'infezione in v...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
DMEM	Life Technologies	11965-084
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
AO/PI Solution	Nexcelom Bioscience	CSK-0102
Disposable Counting Chamber	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100
			EQUIPMENT
Cellometer Vision	Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision Software	Nexcelom Bioscience