Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, görüntü sitometrisi kültür ev sahibi hücrelerle ilişkili olarak patojenik mantarların ölçümü için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu teknik, CFU sayımı için bir alternatif olarak kullanılabilir.

Özet

Bu Candida albicans, Histoplasma capsulatum ve Cryptococcus neoformans gibi patojenik maya hücresel patogenezi mekanizmaların Çalışmaları genellikle birim analiz veya akım sitometri oluşturan koloni kullanarak maya miktar takip memeli ana veya ana hücreler (yani makrofajlar) enfeksiyonu kullanır. Koloni oluşturan birim numaralandırma alanında en sık kullanılan yöntem olsa da, bu tekniğin büyüme karşılaştırırken özellikle endişe vericidir katı ortam ve düşük ve / veya değişken kaplama verimliliği, bazı mantar türlerinin yavaş büyüme de dahil olmak üzere, dezavantajları ve sınırlamaları vardır Yabani tip ve mutant. Flow sitometri maya canlılığı ile ilgili hızlı bir niceliksel bilgi sağlayabilir, ancak, patojenik maya için akım sitometrik algılama benimsenmesinin yüksek maliyet ve biyogüvenlik konuları da dahil olmak üzere pratik nedenlerle bir dizi için sınırlı kalmıştır. Burada, bir görüntü tabanlı göstermekmakrofajlar ile birlikte kültür canlı patojenik maya ölçümü için Cellometer Vizyon (Bioscience Nexcelom, LLC) kullanarak sitometrik yöntem. Histoplasma capsulatum ve Candida albicans H.:. Çalışmalarımız iki insan fungal patojenlerin tespit odaklanmak capsulatum makrofaj phagosome içinde çoğaltarak makrofaj kolonize ve burada, biz kantitatif H. büyüme değerlendirmek görüntü sitometrisi ile birlikte akridin turuncu / propidyum iyodür boyaması kullanılarak bir RAW 264.7 makrofajlarda capsulatum mayalar. Bizim yöntemi sadakatle birim numaralandırma oluşturan geleneksel koloni ile ölçülen özetlediği büyüme trendleri, ancak önemli ölçüde artmış duyarlılık ile. Ayrıca, doğrudan C. bir GFP-ifade suşu ile canlı makrofaj enfeksiyonu değerlendirmek albicans. Bizim metodoloji ilişki zekâ önemli insan fungal patojenlerin tespiti ve ölçümü için bir, hızlı, doğru ve ekonomik bir araç sunuyors konakçı hücreler sunar.

Giriş

Kendi ana ve / veya ana hücreleri ile birlikte patojenik mantarların çalışmalar genellikle bir zaman boyunca veya farklı enfeksiyon koşullar altında canlı mantar hücreleri ölçümü gerektirir. Koloni oluşturan birim sayımı (CFU) uygun bir mantar hücre sayısı ölçülmüştür hangi standart bir yöntem olup, ancak bu teknik, çeşitli dezavantajları ve sınırlamaları vardır. İlk olarak, birçok mantar türleri yavaş büyüyen vardır. Katı ortam üzerinde görünür kolonilerin büyüme önemli ölçüde araştırma hızını yavaşlatan, 1-2 hafta sürebilir. Birkaç seyreltme kolonilerin sayılabilir miktarda sağlamak için kaplama gerekir çünkü ikinci, CFU kaplama sırasında örneklerin manipülasyon, zahmetli bir süreçtir. Kaplama verimi de% 100'ün altında, çünkü Üçüncü olarak, CFU sayısını kaplama canlı organizmaların sayısı genellikle daha düşüktür. Örneğin, dimorfik fungal patojen Histoplasma capsulatum için kaplama verimliliği% 90 kadar yüksek olabilir, ama rutin olarak düşük olabilir% 30 ve ilgili mantar dimorph Paracoccidioides brasiliensis, 1, 2 (% 10) daha düşüktür. Candida albicans için kaplama verimi de değişkenlik 3 tabidir. Birçok durumda, bu ölü ve / veya metabolik olarak aktif olmayan hücrelerin varlığı ve konsantrasyonu belirlemek için yararlı olacaktır, oysa Son olarak, CFU analizi, katı ortam üzerinde büyüme oluflturabildikleri sadece canlı ve aktif olarak bölünen hücreler için hesaplar.

Daha önce, çeşitli patojenik mantar türlerinin miktarının tayini için akış sitometrisi ile 4-6 yöntemler tarif edilmiştir. Ancak, paylaşılan akış sitometrelerinde biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL2) veya BSL3 düzeyinde patojenler ile ile ilgili biyogüvenlik muhafaza sorunları nedeniyle, bu tekniğin benimsenmesi sınırlı kalmıştır. Akım sitometri gibi, görüntü sitometri hücre miktarının bir hassas ve hızlı bir yöntemdir. Ancak, görüntü sitometri karşılaştırılabilir sonuçlar 7 ile maliyetinin bir kısmını yapılabilir -11. Burada, ev sahibi hücrelerle ilişkili olarak patojenik mantarların görüntü sitometrisi gerçekleştirmek için yöntemler tarif eder. Biz iki insan mantar patojenleri kullanarak yöntemleri göstermek: Histoplasma capsulatum ve Candida albicans H.. capsulatum solunum hastalığı neden olan bir dimorfik fungal patojendir, insanlarda, o kadar tomurcuklanan maya büyür ve makrofaj içinde çoğaltır Candida albicans bazen kandidiyazis neden olan bir insan ortakçı türdür.. Biz görüntü sitometri görselleştirme yeteneği ile birlikte, bu maya hızlı ölçümü sağlar olduğunu göstermektedir.

Protokol

1. H. ile makrofajlar enfeksiyonu capsulatum, C. albicans

  1. Enfekte edilmeden önce, 16 saat, 24-yuvalı plakalar içinde istenilen yoğunlukta tohum makrofajlar. Bu protokol, iyi bir 3.0 x 10 5 hücre yoğunluğu / kullanıldı.
  2. Bir enfeksiyon çokluğu istenen (İB) de log-fazı büyümesinde mantar hücreleri ekleyin. Bu protokol İçişleri Bakanlığı bir dizi (- 5.0 0.2) ağırlayacak. H. ile RAW264.7 makrofaj enfeksiyon için capsulatum, biz İçişleri Bakanlığı 0.2 kullanılır.
  3. 1.5 saat fagositoz izin vermek için sonrasında, hücre-dışı Mantar çıkarmak için PBS ile makrofajlar üç kez yıkayın.
  4. Numune analizinden önce, istenilen sayıda saat süreyle inkübe edin. (Bizim deneyde 0.2) İçişleri Bakanlığı düşük de, enfekte makrofaj hücreleri birkaç gün için geçerli kalır ve örnekleri yaklaşık her 12-24 saat analiz edilebilir.

2. Makrofaj Lizis

  1. Makrofaj hücrelerinden mantar kurtarmak için, ortamı çıkarmak PBS ile 3 kez yıkayın, ve0.5 ml steril su ekleyin. Bu koşullar altında, makrofajlar lize ve mantar hücreleri gibi kalır.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
  3. Buz üzerinde tutmak, steril tüpe lizat aktarın.
  4. Ayrı bir tüpe 20 ul lizat aktarın, daha sonra 20 ul AO / PI solüsyonu ekleyin. "Numune Hazırlama Resim Sitometrik Analizi": doğrudan 5. adıma geçin

3. CFU Kaplama

  1. Medya lizatları on-kat seyreltme (adım 2.3) yapın.
  2. Her seyreltme plaka 100 ul, SMM-agaroz plakalar üzerinde, yinelenen. 7-8 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir odasında inkübe edin.
  3. El 100 en az ve 1000 farklı koloniler en fazla gösteren plakalar üzerinde koloniler sayılır.

4. Canlı Makrofajlar içinde Mantarlar Görselleştirme

  1. Canlı makrofajlar toplamak için PBS ile hücreler 3 kez yıkayın. 4, 30 dakika boyunca 0.5 ml PBS ile inkübe ekleme ° C
  2. Doku kültürü kuyulardan makrofajlar kaldırmak için, hafifçe birkaç kez aşağı yukarı pipet ve. Buz üzerinde tutmak, steril tüpe sıvı aktarın.
  3. Ayrı bir tüp 20 ul örnek aktarın, sonra 20 ul AO / PI çözüm ekleyin. "Görüntü Sitometrik Analizi için Numune Hazırlama": doğrudan 5. adıma geçin.

5. Görüntü Sitometrik Analizi için Numune Hazırlama

  1. İyice hedef örneğin pipet ve daha sonra tek hücre sayım odası içine örnek 20 ul aktarın.
  2. Hücreler 30 sn için odasına yerleşmek için izin verin.
  3. Görüntü sitometresinin içine odası sayma yerleştirin.

6. Cellometer Cihaz Kurulumu

  1. Sisteme VB-535-402 ve VB-660-502 ve yerine oturduğundan emin olun: Floresan Optik Modülleri yerleştirin.
    1. VB-535-402 kişide (475 nm uyarma, 535 nm emisyon) akridin turuncu ve GFP tespiti için kullanılır.
    2. VB-660-502 (excitatiüzerine, 540 nm dalga boyunda, 660 nm emisyon), propidyum iyodür tespiti için kullanılır.
  2. Görüntü sitometresinin açın ve beraberindeki yazılımını açın.

7. Cellometer Yazılım Kurulumu

  1. Önceden "Test Tipi" ve Testi Açılır Menü içinde "Hücre Tipi" seçeneğini seçin.
    1. Canlılığı için, tahlil akridin turuncu ve propidium iyodür algılama için optimize edilmiştir.
    2. Candida albicans enfeksiyonun tespit edilmesi için, tahlil GFP tespiti için optimize edilmiştir.
  2. Üst "Seçenekler" i seçin ve "alın, Background Image" tıklayın ve işlemi tamamlamak için izin verir.
  3. "Önizleme Parlak-Alan Resim" tıklayın.

8. Resim Alma Prosedürü

  1. Görüntü sitometresinin içine hazırlanan örnek odası yerleştirin.
  2. Odak düğmesini kullanın ve odağı ayarlayın.
  3. Bir kez odak, "Count" tıklayın ve görüntü elde etme işlemi tamamlamak için izin verir.
  4. Remotek sayma odası ettik ve uygun bertaraf edin.

9. Görüntü Veri Analizi

  1. Konsantrasyon ve canlılığı ölçüm
    1. Sayma tamamlandıktan sonra, hedef hücrelerin konsantrasyonuna ve canlılık sonuç sayfasında görüntülenir.
    2. Candida albicans enfeksiyonu deneyde GFP hücre popülasyonu analizi için FCS Express 4 içine veri ihracat "İhracat" tıklayın.
  2. Candida albicans, infekte olmuş hücrelerin FCS Hızlı analizi
    1. FCS Express 4 ve arsa bir floresan histogram sonuçları içine ". NXDAT" dosyasını içe aktarın.
    2. Candida albicans ile enfekte olmuş hücreler topluluğundaki yüzdesini tespit etmek için histogram hücre popülasyonu kapı uygulamak.

Sonuçlar

Biz H. büyüme izlemek için Cellometer Vizyon görüntü sitometresinin kullanılır makrofaj hücrelerinde capsulatum. RAW 264.7 hücreleri H. ile enfekte edildi Çeşitli zaman noktalarında capsulatum maya hücreleri ve, örnekler görüntü-bazlı sitometrik analizi ile AO / PI boyama tabi tutuldu. Buna paralel olarak, örnekler geleneksel CFU numaralandırma ile analiz edildi. Her zaman noktasında, örnekler makrofajlar eritmek için su içinde inkübe edildi ve serbest kalan ...

Tartışmalar

Resim sitometri kullanıcı yüksek kaliteli çekim ve, özel yazılım kullanarak, hücrelerin hızlı ölçümü yapmak için izin verir. Mikrobiyal patogenez alanında görüntü sitometrisi benimsenmesine bir potansiyel bir sorun sayılması için mikrop memeli konak hücreleri arasında hücre, karışık bir popülasyonu içinde mevcut olmasıdır. Burada, görüntü sitometri in vitro makrofaj enfeksiyon sırasında canlı patojenik maya ölçümü için kullanılabilir olduğunu göstermektedir...

Açıklamalar

Yazarlar Leo Li-Ying Chan ve Benjamin Paradis Nexcelom Biyobilim LLC çalışanlarıdır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
DMEMLife Technologies11965-084
Fetal Bovine SerumLife Technologies16000044
AO/PI SolutionNexcelom BioscienceCSK-0102
Disposable Counting ChamberNexcelom BioscienceCHT4-SD100
EQUIPMENT
Cellometer VisionNexcelom Bioscience
Cellometer Vision SoftwareNexcelom Bioscience

Referanslar

  1. Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
  2. Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
  3. Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
  4. Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
  5. Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
  6. Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
  7. Chan, L. L. -. Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
  8. Chan, L. L. -. Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
  9. Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
  10. Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
  11. Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
  12. Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
  13. Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
  14. Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
  15. Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

EnfeksiyonSay 76MikrobiyolojiEnfeksiyon Hastal klarT pmm nolojiH cresel BiyolojiMolek ler BiyolojiGenetikPatolojiMantar BilimBakterimakrofajlarMantarlarCandidaCandida albicansMayaHistoplasmaG r nt sitometrimakrofajmantarpropidium iyod rakridin turuncuCellometer Vizyonh creg r nt lemeh cre k lt r

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır