Uso de Citometria de imagem para quantificação de fungos patogênicos em associação com células do hospedeiro

Resumo

Aqui, demonstramos como citometria de imagem pode ser usada para quantificação de fungos patogénicos em associação com as células hospedeiras em cultura. Esta técnica pode ser usado como uma alternativa para CFU enumeração.

Resumo

Estudos dos mecanismos de patogênese celulares de leveduras patogênicas como a Candida albicans, Histoplasma capsulatum e Cryptococcus neoformans comumente empregam infecção de hospedeiros mamíferos ou células hospedeiras (ou seja, macrófagos), seguido pela quantificação de leveduras utilizando análise de unidade formadora de colônia ou citometria de fluxo. Enquanto a unidade de formação de colónia enumeração tem sido o método mais comummente utilizado no campo, esta técnica tem as desvantagens e limitações, incluindo crescimento lento de algumas espécies de fungos em meios sólidos e eficiências de baixo e / ou variável de revestimento, que é de preocupação particular quando se compara o crescimento de estirpes de tipo selvagem e mutante. A citometria de fluxo podem proporcionar informação quantitativa rápida quanto viabilidade celular, no entanto, a adopção de citometria de fluxo para a detecção de leveduras patogénicas tem sido limitada por um número de razões práticas, incluindo o seu elevado custo e as considerações de biossegurança. Aqui, nós demonstramos uma baseada em imagemmetodologia de citometria usando a visão Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC), para a quantificação de leveduras patogênicos em co-cultura com macrófagos. Nossos estudos concentram-se na detecção de dois fungos patógenos humanos: Histoplasma capsulatum e Candida albicans H.. capsulatum coloniza macrófagos alveolares, replicando dentro do fagossoma do macrófago, e aqui, nós quantitativamente avaliar o crescimento de H. leveduras capsulatum em RAW 264,7 macrófagos usando laranja de acridina / coloração iodeto de propídio em combinação com a citometria de imagem. Nosso método fielmente recapitula as tendências de crescimento, medida pela unidade formadora de colônia tradicional enumeração, mas com um aumento significativo de sensibilidade. Além disso, avaliar diretamente a infecção de macrófagos ao vivo com uma cepa GFP-expressando de C. albicans. Nossa metodologia oferece um meio rápido, preciso e econômico para a detecção e quantificação de importantes fungos patógenos humanos em associação sagacidadeAs células hospedeiras h.

Introdução

Estudos de fungos patogénicos em associação com os seus hospedeiros e / ou células hospedeiras exigem frequentemente a quantificação de células de fungos viáveis ​​ao longo de um curso de tempo ou sob diferentes condições de infecção. Enumeração das unidades formadoras de colónias (UFC) é o método padrão pelo qual o número de células de fungos viáveis ​​foi medida, no entanto, esta técnica tem várias desvantagens e limitações. Em primeiro lugar, muitas espécies de fungos são de crescimento lento. O crescimento das colônias visíveis em meios sólidos pode levar 1-2 semanas, diminuindo significativamente o ritmo da investigação. Por outro lado, a manipulação de amostras durante CFU chapeamento é um processo laborioso, uma vez que várias diluições deve ser revestida para garantir um número de colónias contáveis. Em terceiro lugar, o número de UFC é tipicamente menor do que o número de organismos viáveis ​​plaqueadas porque a eficiência de plaqueamento é bem abaixo de 100%. Por exemplo, a eficiência de revestimento para o dimórfico Histoplasma capsulatum patógeno fúngico pode ser tão alto como 90%, mas são habitualmente tão acessível quanto30% e são ainda mais baixos (10%) para o fungo relacionado Dimorfa Paracoccidioides brasiliensis ^{1, 2.} Eficiência chapeamento de Candida albicans também está sujeito à variabilidade ^3. Finalmente, a análise de CFU representa apenas as células vivas e dividindo activamente capazes de estabelecer o crescimento em meios sólidos, ao passo que, em muitas situações, pode ser útil para determinar a presença e concentração de células mortas inactivos e / ou metabolicamente.

Anteriormente, os métodos de citometria de fluxo para a quantificação de várias espécies de fungos patogénicos tem sido descrita ^4-6. No entanto, devido a questões de biossegurança de contenção envolvidos com o uso de nível de biossegurança 2 (BSL2) ou patógenos de nível BSL3 em cytometers fluxo compartilhados, a adoção dessa técnica tem sido limitada. Como citometria de fluxo, citometria de imagem é um método sensível e rápido de quantificação celular. No entanto, a imagem de citometria pode ser realizada a uma fracção do custo com resultados comparáveis ^{​​7 -}11. Aqui, descrevemos os métodos para a realização de citometria de imagem de fungos patogênicos em associação com células hospedeiras. Nós demonstramos nossos métodos usando dois fungos patógenos humanos: Histoplasma capsulatum e Candida albicans H.. capsulatum é um fungo dimórfico que causa doença respiratória, em seres humanos, que cresce levedura como brotamento e replica no interior de macrófagos alveolares Candida albicans é uma espécie comensais humanos que provoca ocasionalmente candidíase.. Nós mostramos que a citometria de imagem permite uma rápida quantificação dessas leveduras, juntamente com a capacidade de visualização.

Protocolo

1. Infecção de macrófagos com H. capsulatum, Candida albicans

1. 16 horas antes da infecção, os macrófagos de sementes com uma densidade desejada em placas de 24 poços. Neste protocolo, foi utilizada uma densidade de 3,0 x 10 ⁵ células / poço.
2. Adicionar células fúngicas em crescimento de fase log a uma multiplicidade desejada de infecção (MOI). Este protocolo pode acomodar uma gama de MOI (0,2-5,0). Para a infecção de macrófagos RAW264.7 com H. capsulatum, foi utilizada uma MOI de 0,2.
3. Após 1,5 horas para permitir a fagocitose, macrófagos lavar três vezes com PBS para remover fungos extracelulares.
4. Incubar número desejado de horas antes da análise de amostras. Em baixa MOI (0,2 na nossa experiência), células de macrófagos infectados permanecem viáveis ​​durante vários dias, e as amostras podem ser analisadas aproximadamente a cada 12-24 horas.

2. Lise de macrófagos

1. Para libertar os fungos a partir de células de macrófagos, ao remover a mídia, lavar 3 vezes com PBS, eadicionar 0,5 ml de água estéril. Sob estas condições, os macrófagos e irá lisar células fúngicas permanecerá intacta.
2. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
3. Transferir lysate para tubo estéril, manter em gelo.
4. Transferir 20 uL de ligado a um tubo separado, em seguida, adicionar 20 ul AO / PI solução. Prosseguir diretamente para a etapa 5: "Preparação de Amostras para análise por citometria de imagem"

3. UFC chapeamento

1. Realizar diluição de dez vezes de lisados ​​(do passo 2.3) em meios.
2. Placa de 100 ul de cada diluição em duplicado, em placas HMM-agarose. Incubar as placas numa câmara húmida a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 7-8 dias.
3. Contar manualmente colônias em placas indicam um mínimo de 100 e um máximo de 1.000 colônias distintas.

4. Visualização de fungos no interior dos macrófagos ao vivo

1. Para a coleta de macrófagos ao vivo, lave as células três vezes com PBS. Adicionar 0,5 ml de PBS, e incubar durante 30 min a 4 ° C.
2. Para remover os macrófagos dos poços de cultura de tecidos, pipeta suavemente para cima e para baixo várias vezes. Transferência líquida para tubo estéril, manter em gelo.
3. Transferir 20 uL de amostra a um tubo separado, em seguida, adicionar 20 ul AO / PI solução. Prosseguir diretamente para a etapa 5: "Preparação de Amostras para análise por citometria de imagem".

5. Preparação de amostras para análise por citometria de imagem

1. Pipetar a amostra-alvo e completamente em seguida, transferir 20 mL de amostra para a célula descartável câmara de contagem.
2. Permitir que as células se instalar na câmara por 30 segundos.
3. Insira câmara de contagem para o citômetro de imagem.

6. Configuração do Instrumento Cellometer

1. Insira a ótica de fluorescência Módulos: VB-535-402 e VB-660-502 para o sistema e verifique se eles estão presos no local.
   1. VB-535-402 (excitação a 475 nm, emissão a 535 nm), é usada para a detecção de laranja de acridina e de GFP.
   2. VB-660-502 (excitatiem 540 nm, emissão a 660 nm) é utilizado para a detecção de iodeto de propídio.
2. Ligue o citômetro de imagem e abrir o software que o acompanha.

7. Instalação de Software Cellometer

1. Selecione o preset "Tipo de Ensaio" e "Tipo de célula" no menu suspenso de Ensaio.
   1. Para a viabilidade, o ensaio é optimizado para a detecção de laranja de acridina e iodeto de propídio.
   2. Para a detecção de infecção por Cândida albicans, o ensaio é optimizado para a detecção de GFP.
2. Selecione "Opções" na parte superior e clique em "Take imagem de fundo", e permitir que a operação seja concluída.
3. Clique em "Imagem de campo claro."

8. Imagem Procedimento de Aquisição

1. Insira na câmara de amostra preparada para o citômetro de imagem.
2. Use o botão de foco e ajustar o foco.
3. De vez em foco, clique em "Count", e permitir que a operação de aquisição de imagem para ser concluído.
4. Remove a câmara de contagem descartáveis ​​e descartar adequadamente.

9. Imagem de Análise de Dados

1. Concentração e de medição da viabilidade
   1. Uma vez que a contagem é concluída, a concentração e a viabilidade das células-alvo são apresentados na página de resultado.
   2. Clique em "Exportar" para exportar os dados para o FCS Express 4 para análise da população celular da GFP em Candida albicans experiência infecção.
2. Análise FCS expresso de células infectadas com Cândida albicans
   1. Importe o arquivo ". NXDAT" em FCS Express 4 e enredo os resultados em um histograma de fluorescência.
   2. Aplicar portão população de células com o histograma para determinar a percentagem de população de células infectadas com Cândida albicans.

Resultados

Usamos o Cellometer Visão imagem citômetro para monitorar o crescimento de H. capsulatum do macrófago. Células RAW 264.7 foram infectados com H. células de levedura capsulatum e em vários pontos de tempo, as amostras foram submetidas a AO / PI coloração seguida por análise de citometria de imagem baseado. Em paralelo, as amostras foram analisadas por contagem de CFU tradicional. Em cada ponto de tempo, as amostras foram incubadas em água para lisar os macrófagos e as células de lev...

Discussão

Citometria de imagem permite ao usuário capturar imagens de alta qualidade e, usando um software especializado, realizar rápida quantificação de células. Um desafio potencial para a adopção de citometria de imagem no domínio da patogênese microbiana é que os microrganismos sejam contados presente numa população mista de células, incluindo células hospedeiras de mamífero. Aqui, demonstramos que a citometria de imagem pode ser utilizada para a quantificação de leveduras patogénicas viáveis ​​durante...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
DMEM	Life Technologies	11965-084
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
AO/PI Solution	Nexcelom Bioscience	CSK-0102
Disposable Counting Chamber	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100
			EQUIPMENT
Cellometer Vision	Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision Software	Nexcelom Bioscience