Использование изображения Цитометрии для количественного определения патогенных грибов в связи с клетки-хозяева

Резюме

Здесь показано, как изображение цитометрии может использоваться для количественного определения патогенных грибов в связи с хост клеток в культуре. Этот метод может быть использован в качестве альтернативы перечисление КОЕ.

Аннотация

Исследования клеточных механизмов патогенеза патогенные дрожжи, такие как Candida Albicans, Histoplasma capsulatum и Cryptococcus neoformans обычно используют заражение хозяев-млекопитающих или клетки-хозяева (т.е. макрофаги) с последующим использованием дрожжей количественного анализа колониеобразующих единицы или проточной цитометрии. В то время как колониеобразующие единицы перечисление была наиболее широко используемый метод в данной области, этот метод имеет недостатки и ограничения, в том числе медленный рост некоторых видов грибов на твердой среде и низкой и / или переменной эффективности покрытие, которое представляет особый интерес при сравнении роста дикого типа и мутантных штаммов. Проточная цитометрия может обеспечить быстрое количественной информации о дрожжи жизнеспособности, однако, применение проточной цитометрии обнаружения патогенных дрожжей было ограничено по ряду практических причин, включая его высокой стоимости и биологической соображений. Здесь мы демонстрируем на основе образацитометрические методологии с использованием Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience ООО) для количественного определения жизнеспособных патогенных дрожжей в совместной культуре с макрофагами. Наши исследования направлены на выявление двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum колонизирует альвеолярных макрофагов путем репликации в макрофагах фагосома, и здесь, мы количественно оценить рост H. capsulatum дрожжей в RAW 264.7 макрофагами использованием акридиноранжа / пропидий йодида окрашивания в сочетании с изображения цитометрии. Наш метод точно повторяет тенденции роста как измеряется традиционными колониеобразующая единица перечисления, но со значительно более высокой чувствительностью. Кроме того, мы непосредственно оценить инфекции живых макрофагов с GFP-экспрессирующих штамм C. Albicans. Наша методика предлагает быстрое, точное и экономичное средство для обнаружения и количественного определения важных человеческих патогенных грибов в остроумии ассоциациич клетки хозяина.

Введение

Исследования патогенных грибов в связи с их хозяев и / или клетки-хозяева, часто требуют количественного жизнеспособных клеток грибов за время курса или в других условиях инфекции. Перечень колониеобразующих единиц (КОЕ) представляет собой стандартный метод, посредством которого количество жизнеспособных клеток грибов были измерены, однако, этот метод имеет ряд недостатков и ограничений. Во-первых, многие виды грибов растут медленно. Рост видимые колонии на твердой среде может занять 1-2 недели, что значительно замедляет темпы научных исследований. Во-вторых, манипуляции образцов в процессе покрытия КОЕ это трудоемкий процесс, так как несколько разведения должны быть покрыты для обеспечения счетного числа колоний. В-третьих, количество КОЕ, как правило, ниже, чем количество жизнеспособных организмов покрытием, так как покрытие эффективность значительно ниже 100%. Например, покрытие для эффективности диморфными грибкового патогена Histoplasma capsulatum может быть выше, чем 90%, но обычно по цене от30% и даже ниже (10%) для соответствующих грибковых диморф Paracoccidioides Brasiliensis ^{1, 2.} Покрытие эффективности Candida Albicans также подвержен изменчивости ^3. Наконец, анализ КОЕ составляет только живых и активно делящиеся клетки, способные устанавливать роста на твердой среде, в то время как во многих ситуациях, было бы полезно, чтобы определить наличие и концентрацию мертвыми и / или метаболически неактивные клетки.

Ранее методов проточной цитометрии для количественного определения нескольких патогенных видов грибов были описаны ^4-6. Однако из-за биобезопасности сдерживания проблемы при использовании уровня биобезопасности 2 (BSL2) или BSL3 уровня патогенов на общих цитометрах потока, принятие эта техника была ограничена. Как проточной цитометрии, изображения цитометрии является чувствительным и быстрый метод клеточной количественной оценке. Тем не менее, изображение цитометрии могут быть выполнены в часть стоимости с аналогичными результатами ^{7 -}11. Здесь мы описываем методы для выполнения изображение цитометрии патогенных грибков в сочетании с клетками-хозяевами. Мы демонстрируем наши методы с использованием двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum является диморфными грибкового патогена, вызывающих респираторные заболевания, а в людях, он растет как начинающим дрожжей и повторяет в альвеолярных макрофагах Candida Albicans является человеком синантропных видов, которые иногда вызывает кандидоз.. Мы покажем, что изображения цитометрии позволяет быстрое количественное эти дрожжи, вместе с визуализацией возможности.

протокол

1. Инфицирование макрофагов H. capsulatum, C. Albicans

1. 16 часа до инфицирования, семена макрофагов при желаемой плотности в 24-луночных планшетах. В этом протоколе, плотность 3,0 х 10 ⁵ клеток / лунка была использована.
2. Добавить грибковые клетки в логарифмической фазе роста в желаемом множественности инфекции (MOI). Этот протокол может вместить ряд МВД (0,2 - 5,0). Для заражения RAW264.7 макрофагов с H. capsulatum, мы использовали МВД 0.2.
3. После 1,5 часов, чтобы обеспечить фагоцитоза, макрофаги мыть три раза PBS для удаления внеклеточных грибы.
4. Инкубируют в течение желаемого количества часов до анализа проб. При низких МВД (0,2 в наших экспериментах), инфицированные клетки макрофаги оставаться жизнеспособными в течение нескольких дней, и образцы могут быть проанализированы примерно каждые 12-24 часа.

2. Макрофагов Лизиса

1. Чтобы освободить грибов из макрофагов, не извлекайте носитель, промыть 3 раза PBS идобавить 0,5 мл стерильной воды. В этих условиях, макрофаги и будет лизировать клетки грибов будет оставаться неизменным.
2. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
3. Передача лизата стерильную пробирку, держать на льду.
4. Передача 20 мкл лизата в отдельную пробирку, затем добавляют 20 мкл AO / PI раствора. Перейдите к шагу 5: «Подготовка образцов для изображения цитометрии"

3. КОЕ Покрытие

1. Выполните десятикратном разведении лизатов (с шагом 2,3) в средствах массовой информации.
2. Плита 100 мкл каждого разведения, в двух экземплярах, на ХМ агарозном пластин. Планшеты инкубируют в увлажненной камере при 37 ° С с 5% СО ₂ в течение 7-8 дней.
3. Вручную подсчет колоний на чашках отображения не менее 100 и не более 1000 отдельных колоний.

4. Визуализация грибов в Онлайн-макрофагов

1. Для сбора живых макрофаги, мыть клетки 3 раза с PBS. Добавить 0,5 мл PBS и инкубировать в течение 30 мин при 4 ° C.
2. Для удаления макрофагов из колодцев культуре тканей, мягко пипетку вверх и вниз несколько раз. Передача жидкости стерильную пробирку, держать на льду.
3. Передача 20 мкл образца в отдельную пробирку, затем добавляют 20 мкл AO / PI раствора. Перейдите к шагу 5: «Подготовка образцов для изображения цитометрии".

5. Подготовка образцов для изображения цитометрии

1. Внесите целевой выборки тщательно, а затем передать 20 мкл образца в ячейку одноразовые Счетную палату.
2. Разрешить клетки оседают в камере в течение 30 сек.
3. Вставьте счетной камеры в образ цитометром.

6. Cellometer настроек прибора

1. Вставьте флуоресценции Модули Оптика: VB-535-402 и VB-660-502 в систему и убедиться, что они встали на место.
   1. VB-535-402 (возбуждение при 475 нм, эмиссия при 535 нм) используется для акридиноранжа и GFP обнаружения.
   2. VB-660-502 (excitatiна при 540 нм, эмиссия при 660 нм) используется для обнаружения пропидий йодида.
2. Включите изображения цитометром и открыть соответствующее программное обеспечение.

7. Cellometer по установке программного обеспечения

1. Выберите пресет "типа анализа" и "Тип клетки" в анализе выпадающего меню.
   1. Для жизнеспособности, анализ оптимизирован для акридинового оранжевого и пропидия иодида обнаружения.
   2. Для обнаружения инфекции Candida Albicans, анализ оптимизирован для GFP обнаружения.
2. Выберите "Настройки" в верхнем и нажмите "Take фонового изображения", и позволяют завершения операции.
3. Нажмите на кнопку "Предварительный просмотр светлого поля изображения".

8. Процедура Image Acquisition

1. Введите подготовленный образец камеры в образ цитометром.
2. Используйте ручку фокусировки и регулировки фокуса.
3. После того как в фокусе, нажмите на кнопку "Count" и позволить операцию захвата изображения, чтобы закончить.
4. Ремове одноразовых счетной камере и утилизировать надлежащим образом.

9. Анализ данных изображений

1. Концентрация и жизнеспособности измерения
   1. После подсчета завершена, концентрации и жизнеспособности клетки-мишени, выводятся в странице результатов.
   2. Нажмите на кнопку "Экспорт" для экспорта данных в ФТС Express 4 для сотовых популяционный анализ GFP в эксперименте инфекции Candida Albicans.
2. FCS Экспресс-анализ Candida Albicans-инфицированные клетки
   1. Импорт ". NXDAT" файл в ФТС Express 4 и сюжет приводит к флуоресценции гистограммы.
   2. Применение ворота клеточной популяции на гистограмме, чтобы определить процент населения Candida Albicans-инфицированных клеток.

Результаты

Мы использовали Cellometer цитометром изображения видения для контроля роста H. capsulatum в клетки макрофагов. RAW 264.7 клетки были инфицированы H. capsulatum дрожжевых клетках и в различные моменты времени, образцы подвергали AO / PI последующим окрашиванием на основе изображения цитометрии. Па...

Обсуждение

Изображение цитометрии позволяет пользователю захватить высокое качество изображения и, используя специализированное программное обеспечение, выполнить быстрое количественное клеток. Один потенциальный вызов принятием изображения цитометрии в области микробного патогенеза явля?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
DMEM	Life Technologies	11965-084
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000044
AO/PI Solution	Nexcelom Bioscience	CSK-0102
Disposable Counting Chamber	Nexcelom Bioscience	CHT4-SD100
			EQUIPMENT
Cellometer Vision	Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision Software	Nexcelom Bioscience