ניתוח התנהגות תפוקה גבוהה אוטומטי בזחלי דג הזברה

Summary

המעבדה שלנו פיתחה מערכת שהיא שימושית לצורך זיהוי של כמה התנהגויות שונות בזחלי דג הזברה 7 ימים בת הדמיה אוטומטית תפוקה גבוהה רומן. המערכת יכולה לשמש לאיתור שינויים עדינים בהתנהגות לאחר הזחלים שנחשפו לרעלים או תרופות סביבתיים.

Abstract

יצרנו מערכת הדמיה תפוקה גבוהה חדשנית לניתוח התנהגות בזחלי דג הזברה 7 ימים בת בצלחות רב נתיבים. מערכת זו מודדת התנהגויות ספונטניות והתגובה לגירוי מרתיע, אשר מוצגת לזחלים באמצעות מצגת PowerPoint. את התמונות שתועדו מנותחות עם מאקרו ImageJ, אשר באופן אוטומטי מחלק את ערוצי הצבע, מחסיר את הרקע, וחל סף לזהות מיקום זחלים בודד בסמטאות. אז אנחנו יכולים לייבא את הקואורדינטות לגיליון Excel לכמת מהירות השחייה, העדפה לקצה או בצד של הנתיב, התנהגות מנוחה, thigmotaxis, מרחק בין זחלים, והתנהגות הימנעות. שינויים קלים בהתנהגות מזוהים בקלות באמצעות המערכת שלנו, מה שהופך אותו לשימושי עבור ניתוחים התנהגותיות לאחר חשיפה לרעלים או תרופות סביבתיים.

Introduction

דג הזברה הופכת מודל פופולרי למדעים גנטיים, התפתחותי והתנהגותי ^1-4. הם בוקעים מchorions על ידי לאחר הפריה ימים 2-3 (DPF), לפתח באופן מלא על ידי איברים מתפקדים DPF 4-5, ולהציג מספר גדול של התנהגויות של 7 DPF ^5,6. זחלי דג הזברה מתאימים בצורה אידיאלית לניתוחי תפוקה גבוהה בגלל הגודל הקטן שלהם ^7,8. תוכנה זמינה מסחרי עבור ניתוחים אוטומטיים של התנהגות בדג זברת הזחל ומבוגר ^9-14. עם זאת, תוכנה זו יכולה להיות יקרה ויש לו אפשרויות מוגבלות למדידת התנהגויות מורכבות של זחלי דג הזברה בצלחות רב כן.

יצרנו מערכת הדמיה תפוקה גבוהה רומן שהיא זול להקמה ויכול לכמת את מספר ההתנהגויות שונות ב7 זחלי דג הזברה DPF ^15,16. המערכת מאפשרת לנו לבחון במהירות וביעילות הפרעות התנהגותיות עדינות לאחר חשיפה עוברית למספרתרופות וtoxicants סביבתי ^16-18.

המערכת נבנתה באמצעות ארונות מעץ, שבית מצלמה דיגיטלית בחלק העליון של הארון. המצלמה פונה כלפי מטה אל החלק התחתון של הארון שבו מחשב נייד ממוקם עם המסך כלפי מעלה ^15. זמן לשגות הדמיה משמשת כדי ללכוד את המיקום של הזחלים בסמטאות. זחלים יכולים להיות שוכנו בעד ארבע צלחות רבת או רב גם מסלולים אשר ממוקמות על גבי מסך המחשב הנייד. אנו משתמשים במצגת PowerPoint כגירוי מרתיע כדי שהזחלים להגיב על ידי מתרחק (הימנעות) ושוחה לכיוון הקצה (thigmotaxis) ^15,17. את התמונות מיובאות לImageJ הבמשמש מאקרו אוטומטי לפצל את ערוצי הצבע, לחסר רקע, ולהחיל את סף לזהות זחלי פרט. קואורדינטות רשומות לכל זחל בכל תמונה ויכולות להיות מוכנסת לתוך קובץ Excel שבו אנו משתמשים כדי לכמת והימנעות thigmotaהתנהגות xis, דגים למרחק דגים, לשחות במהירות, וסכום של מנוחה ^16.

Protocol

1. אוסף של עוברי דג הזברה וגיוס זחלים

1. צלחות זכוכית פיירקס עם דשא "מזויף" (עשוי מחוט ירוק) (איור 1) צריכים להיות מוכנסות למכלי עם שחר ועזבו בלמשך שעתיים כדי לאסוף עוברי דג הזברה. מנות הזכוכית המכילות את העוברים צריכים להיות שפך על מסננת כף יד ולשטוף עם מים deionized. את העוברים ואז צריכים להיות מבוגרים במי ביצה. המים הביצה מכילים 60 מ"ג / ליטר של אוקיינוס ​​מיידי במי deionized ו0.25 מ"ג / ל 'של מתילן כחול, המשמש כמעכב עובש.
2. בהתאם להשערה של הניסוי הבודד, ניתן לטפל בעוברים באופן מיידי או במהלך שלבים מסוימים של פיתוח באמצעות toxicants או תרופות. את toxicants והתרופות בדרך כלל מומסים DMSO (בריכוז X 1,000) וצריכים להיות מדולל נוסף ישירות במדיום המים הביצה.
3. במהלך טיפול עוברי וזחל עם תרופות או toxicantים, יכולים להיות שוכנו הזחלים והעוברים בצלחות פטרי עמוקים בצפיפות של כ 50-60 זחלים לכל 50 מ"ל עד ניתוחי ההתנהגות ב7 DPF (פתרון מים ביצה צריך להיות שונה לפחות בכל יום אחר, כדי למנוע התפתחות של פטרייה / חיידק מעוברים מתים).

2. הכנת תבניות לניתוח התנהגות

1. במיוחד התפתח תבניות פלסטיק שבם נמדד 11.7 ס"מ X 7.6 ס"מ X 5 מ"מימ מותאמים אישית שנבנו בתוך הבית. את התבניות יש צורך ליצור נתיבים באמצעות agarose שהוא שפך לתוך צלחות פלסטיק גם בודדות מThermo Scientific. מדד הצלחות גם אחת 12.4 ס"מ X 8.1 ס"מ X 1.2 ס"מ.
2. את התבניות מכילות חמישה נתיבים שבו הצדדים הם בזווית של 60 מעלות. הנתיבים בתבניות הם 3.5 מ"מ גבוה עם בסיס של 18 מ"מ בחלקו העליון שהוא הרחב ביותר ואילו הרוחב התחתון הוא 14 מ"מ. יש פער בין 4 מ"מ נתיבים בתבנית (איור 2).
3. כדי להכין את הנתיבים לשפוך 50 מ"ל של agarose נמס (0.8% agarose בdeionizeמים D עם 60 מ"ג / ליטר מיידי אוקיינוס) בצלחת גם יחידה. אז העובש צריך להיות ממוקם באיטיות על גבי agarose הנוזלית כדי לחסל כל היווצרות בועה וניתן להסיר כאשר agarose מתקררת (שלוקח בערך 45 דקות).
4. נתיבי agarose צריכים להתבצע לא לפני יום אחד לפני הניסוי התנהגותי הוא להיות לרוץ (כדי למנוע התייבשות agarose) יכולים להיות מאוחסנים הנתיבים בטמפרטורת חדר עם את המכסים על הכלים עד בערך 36 שעות. נתיבי agarose יש להשתמש רק בניסוי אחד ולאחר מכן צריכים להיות מושלך.

3. לכידת תמונה

1. עד 20 זחלים יכולים להיות ממוקמים בכל מסלול של הצלחות. בדרך כלל 5 זחלים לכל נתיב המשמשים כדי להקל על המעקב מדויק ביותר של מהירות השחייה ולהפחית את מספר הזחלים שיש צורך לניסוי. יכולות להיות מלאות בסמטאות במי ביצה עם או בלי תרופות או toxicants בהתאם לניסוי. עם זאת, מסלולים לא צריכים להיות Filled את כל הדרך עד שהם ממוקמים בארונות ההדמיה; זה ימנע הצפה. לעקביות, הזחלים צריכים תקופת התאקלמות של עשר דקות אחרי שהם ממוקמים בתבניות agarose ואת מיקומו על גבי מסך המחשב הנייד. יעילות העברת הזחלים מצלחת פטרי לנתיב agarose תעזור להפחית את לחץ זחלים. זה קל כשהם שוכנו בזחלי טנקים רדודים או צלחות פטרי.
2. את ארונות ההדמיה כוללים מצלמה דיגיטלית Canon משמשת לצילום זמן לשגות ומחשב נייד. המצלמה צריכה להיות ממוקמת בחלקו העליון של הארון וכיוון לעבר לחלקו התחתון של הארון שבו מחשב נייד מסך 15.6 אינץ' צריך להיות ממוקם עם המסך כלפי מעלה (איור 3). ארבע צלחות צריכים להיות ממוקמות ביד ישירות על גבי מסך המחשב הנייד. בשלב זה ניתן עקף את הנתיבים במי ביצה או טיפול כימי, כך שהוא ברמה עם החלק העליון של המסלול (כדי לחסל את הצללים בשולי Lanes בתמונות).
3. מצגת PowerPoint משמשת כגירוי מרתיע לזחלים. בכדורים האדומים הנעים בעבר הוצגו בדג הזברה זחלים 6 או 12 צלחות רב גם ^15,17,18. PowerPoint הנוכחי מתחיל עם רקע לבן ריק במשך 15 דקות, ואחרי 15 דקות של בר אדום נע במחצית העליונה של הצלחת (איור 4). על מנת למנוע התחממות יתר של הזחלים, עדיף לרכוש מחשב נייד עם מסך טמפרטורה שאינו עולה מעל 28 מעלות צלזיוס כדי למנוע אידוי של הנוזל בתוך נתיבי agarose, זמן ההדמיה המקסימאלי צריך להיות כל הזמן מתחת לשעה אחת.
4. המצלמה הדיגיטלית צריכה להיות מתוכנת לצילום זמן לשגות, לצלם כל 6 שניות לסכום כולל של 300 תמונות לכל ניסוי. עם זאת, ניתן להתאים את התדירות ואת האורך בהתאם לניסוי והכימות התנהגותית. בכל הפעמים האחרונות הרחבנו ההדמיה הועסקו באמצעות מרווחי זמן בין כל תמונה. Camerניתן להגדיר ברזולוציה נמוכה יותר עבור הדמיה במהירות וידאו (30 פריימים לשנייה). אמנם הרזולוציה הנמוכה מגבילה את ההקלטות לצלחת multiwell אחת, את קלטות הווידאו מתאימות לאירועי שחייה מהירות הדמיה ^15.

4. ניתוח תמונה

1. את התמונות יש לפתוח עם ImageJ ולהשתמש בו עם מאקרו שנכתב במיוחד בבית. מאקרו באופן אוטומטי מחלק את ערוצי הצבע, כך שניתן להסיר את הצבע האדום, מחסיר את הרקע, חל סף, ומזהה את הזחלים על ידי ניתוח חלקיקים. מאקרו העדכני ביותר עבור חמישה ניתוח הזחל ליין הוא Zebrafish_macro25k. השתמש בהנחיות במאקרו כדי להגדיר מספר התמונות, צבע שיורד, סף תמונה, וכו '
2. אחרי כל התמונות מנוהלים באמצעות מאקרו ImageJ, קובץ יוצג תוצאות ויכיל x, y קואורדינטות של הזחלים פרטניים לכל תמונה, יחד עם מספר התמונה ומספר המסלולים.

3. קובץ התוצאות צריך להישמר בפורמט אקסל ומסודר על בסיס רקע ריק לעומת רקע שורה מרגשת ולאחר מכן את המספר היטב. תבנית Excel צריכה להיות בשימוש שיש משוואות שנבנו שבקובעו באופן אוטומטי את המיקום של זחלים בבארות, מרחק בין זחלים, מהירות תנועה, ואת סכום של מנוחה. התבנית הנוכחית של Excel ביותר נוצרה במעבדה 25ib Creton, אשר זמינה על פי דרישה. גרפים מראים קבוצות טיפול שונות צריכים להיות מובנים בתוך גיליון Excel יחד עם מבחני t להשוואה בין קבוצות טיפול ובקרה. ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי נוסף באמצעות SPSS.

תוצאות

במבחנים הקודמים שלנו, תוך שימוש בגירוי מרתיע הכדור המקפץ, זחלי סוג בר שהמטופל מגיבים לכדור לנוע על ידי שהלך לשחות ב( התנהגות ההימנעות) וגם לכיוון הקצוות (התנהגות thigmotaxis) ¹⁵ כן. מאוחר יותר אנו מאשרים כי התנהגות thigmotaxis בassay זה היא מדד של התנהגות הקשורה לחרדה בזחלי דג הזברה ^17. היו הבדלים משמעותיים בתנועת הזחלים הרחק מכדור וההעדפה לקצה בהשוואה לרקע הלבן הריק. התנהגויות אלו גם אושרו בבדיקה החדשה שלנו באמצעות הסרגל האדום המרגש והם אפילו יותר חזקים ^16. יתר על כן, כעת אנו יכולים לדגום מספר גדול יותר של התנהגויות בassay בודד כולל מהירות השחייה, מנוחה, העדפה לסוף או בצד של הבאר, ומרחק בין דגים (איור 5). זחלי בקרה גדלו במי ביצה מראים העדפה מוגברת להיות למטה בצלחת ועל קצה השבילחרה שהם מוצגים עם גירוי מרתיע (נע פס אדום). תוצאות דומות מתקבלות כאשר זחלים גדלים במי ביצה המכילים 1 מיקרוגרם / מיליליטר DMSO, ממס המשמש בדרך כלל להמסת תרופות וtoxicants שונים כ1,000 פתרונות מניות X.

נציג תוצאות מוצגות באיור 5 בזחלי מטופלים עם ביצת מים וDMSO (כקבוצת ביקורת) וריכוזים שונים של חומרי הדברה organophosphate הנפוצים במזונות שאינם אורגניים. התוצאות המוצגות הן דגימה מניסוי אחד. עם זאת, כאשר חזרו, התוצאות מצביעות על כך שמהירות השחייה והתנהגות thigmotaxis משתנה על ידי ריכוזים נמוכים של חומרי ההדברה organophosphate, המחקים את הרמות בצריכת מזון אנושית ^18.

איור 1. מגשי אוסף. מנות פיירקס זכוכית משמשים לאיסוף דוארmbryos מהטנקים הדגים הבוגרים. מכסים מצלחות פיירקס נחתכו ונוסף עם רשתות פלסטיק וחוט ירוק שנתפרו על גבי הרשתות בפלסטיק. זה יוצר אווירה פורה לדג הזברה המבוגר על ידי חיקוי הסביבה הטבעית.

איור 2. תבנית פלסטיק ונתיבי agarose. א) העובש מוצג בצד השמאל. 0.8% agarose הוא שפך לתוך צלחת אחת היטב; העובש מוכנס לאט ולאחר מכן הוסר כאשר agarose מתקררת ב ') את הצלחת על ימין מראה את הנתיבים שנוצרו בagarose ידי תבנית הפלסטיק..

איור 3. ארונות הדמיה. ארונות הדמיה היו specially שנבנה במעבדה שלנו ומשמש לניתוחים התנהגותיים תפוקה גבוהה. מצלמה 15 מגה פיקסל דיגיטלית הייתה מחוברת לחלקו העליון של הארון פונה כלפי מטה על מנת לאסוף תמונות זמן לשגות של הזחלים בצלחות multilane ממוקמות על גבי המסך של מחשב נייד. בין הצלחות והמסך יש מפזר פלסטיק שמשמש למניעת דפוסי moiré בתמונות שנאספו.

איור 4. רקע ריק וגירוי מרתיע-PowerPoint. זוהי PowerPoint הנוכחי המשמש כדי לעורר שינויים התנהגותיים בזחלי דג הזברה. הוא מספק בדלים התנהגותיים בין חזקים) רקע ריק ו-B) בר האדום המרגש.

איור 5. התנהגויות לכמת בassay התפוקה גבוהה. דוגמה להתנהגויות שהם לכמת מassay ההתנהגות שלנו בתוך גיליון Excel שאנו משתמשים עבור x, y קואורדינטות של הזחלים. את הסורגים הלבנים מראים מידע מזחלים שנחשפו לרקע ריק ואת הקווים האדומים מראים מידע מהזחלים נחשפו לבר המרגש האדום ב- PowerPoint. הגרפים מראים את המדידות שניתן להשיג מניתוח התנהגות) אחוז הזחלים למטה בנתיב ', ב') אחוז הזחלים בסוף השביל, C) אחוז הזחלים בקצה השביל, ד) מרחק בין דגים (מ"מ), E) לשחות מהירות של אחוז שאר זחלי הזחלים (מ"מ / דקה), F). בגרפים מוצגים, הנתונים הוא מtreatmאף אוזן גרון של זחלים עם DMSO שליטה וכמה ריכוזים של חומרי הדברה החל .001-0.1 מיקרומטר (רמות הנפוצות בתזונת האדם). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Discussion

בעוד אנו שיפור assay התנהגותי הרומן שלנו ללא הרף, זה תמיד היה שימושי לזיהוי של הימנעות והתנהגות thigmotaxis בזחלי דג הזברה ^15. ניסויים רבים בוצעו כדי לייעל את התוצאות של assay, כגון צבע של גירוי בשימוש, מספר האידיאלי של זחלים לכל נתיב, ואורך של assay התנהגותית. בעבר, השתמשנו בצלחות רב היטב (עם 6 או 12 בארות) ^15,17,18. עם זאת, לאחרונה יצרנו את תבנית נתיב הרומן ליצור מרחב שחייה גדול יותר לזחלים ומאפשרים לנו לאסוף מספר גדול יותר של אמצעים התנהגותיים בassay אחת ¹⁶ (איור 5). שינויים נוספים כוללים וריאציות של שהעל"ל המוצג PowerPoint (תנועה או אורך שונים של assay) ואת הגודל של הנתיבים בשימוש (יש לנו גם תבניות לסמטאות צרות יותר).

נכון לעכשיו, מערכת האוטומטית של תפוקה גבוהה זה היא ייחודית ביכולתו למדוד מגוון רחב של התנהגויות בzebrזחלי afish באותו הזמן, כגון מהירות, הימנעות, קרבה לזחלים אחרים, וthigmotaxis בצלחות רב נתיבים. ניתן להשיג תוצאות במהירות ובמספר גדול של זחלים ניתן לנתח בזמן ההדמיה. המערכת היא גם זולה לבנות ומהירה וקלה להתקנה. מגבלה של שיטה זו היא שלא ניתן להעריך את תנועות 3-D בזחלי דג הזברה. מערכות אוטומטיות העוקבות אחר דג הזברה מבוגר שיש לו את יכולת 3-D וניתן לזהות מגוון רחב יותר של התנהגויות כגון תנועה למעלה או למטה בעמודת המים ^10,19. מגבלה נוספת היא שמערכת ההדמיה שלנו כיום אינה מותאמת לניתוחי תפוקה גבוהה במהירות וידאו. ההדמיה מהירות וידאו אפשרית בעת הגדרת המצלמה לרזולוציה נמוכה יותר ^15, אבל זה מגביל את הניתוח לצלחת אחת.

בשימוש בשיטה חדש שנוצרה "הנתיב", כמה חלקים של assay צריכים להיות מוצאים להורג באופן מדויק. כאשר מניחים את הזחלים בtהוא נתיבים, זה הוא קריטי כדי לוודא את רמת הנוזל היא מאוד רדודה עד שהצלחות ממוקמות על גבי מסך המחשב הנייד. אם הנתיבים מלאים מדי של נוזל, הזחלים יהיו להימלט אל שולי הצלחת. בנוסף, בעת הכנסת התבנית לתוך agarose, יש להקפיד להוריד את התבנית באיטיות רבה. אם העובש מוכנס במהירות רבה מדי, בועות יהוו בagarose ותזוהינה על ידי מאקרו J התמונה כזחלים נוספים. מומלץ כי אם יש לי נתיבי agarose אפילו כמה בועות, עדיף לעשות חדשות.

בעתיד, ברצוננו לייעל את assay ההתנהגות שלנו לנתח התנהגויות אחרות מורכבות כגון למידה בזחלי דג הזברה ולבחון כיצד למידה יכולה להיות מושפעת מחשיפה לרעלים ותרופות בשלבי פיתוח מוקדם. אנחנו עובדים כרגע על מבחני שעשויות להיות שימושית לניתוח התנהגות למידה בה את התוצאות התנהגותיות עשויות להקל על קביעה אילו אזורים במוח הםמושפע toxicants או תרופות מסוימים במהלך פיתוח. מבחני אוטומטיים פותחו למדידת למידת התנהגויות בדג זברת זחלים ²⁰ ומבחנים אלה עשויים להיות amendable להקרנת תפוקה גבוהה על ידי שימוש בתגובת ההימנעות החזקה בצלחות רב נתיבים.

אנו מציעים כי התנהגות assay זה יכול לשמש במחקרים עתידיים לבדיקת ההשפעות התפתחותיות של מספר רב של תרופות וtoxicants. מחקרים מסוג זה מספקים שפע של מידע על גורמי סיכון ספציפיים ולתרום לקביעת הנחיות בטיחות ובריאות טובות יותר לנשים בהריון וילדים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Instant Ocean	That Pet Place	198262
Agarose	Fisher	BP1356-100
Methylene Blue	That Pet Place	214325
Equipment
One well plates	Fisher	12-565-493
Digital camera	Canon	EOS Rebel T1i
Imaging Cabinets	WoodCraft Towers
Laptops	Acer Aspire	Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.
Camera Lens	Canon	EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens
Plastic diffuser	Pendaflex	52345
Software
PowerPoint 2010	Microsoft
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/
Excel 2010	Microsoft
Statistical software	SPSS 20