Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

Özet

Laboratuvarımız 7 günlük eski Zebra balığı larvaları birkaç farklı davranışların tespiti için yararlı bir yeni yüksek verimli otomatik görüntüleme sistemi geliştirdi. Sistem, larva çevresel toksik ya da eczacılık maruz kalmış sonra davranış ince değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.

Özet

Biz çok şeritli plakalar 7 günlük eski Zebra balığı larvaları davranış analizi için yeni bir yüksek verimli görüntüleme sistemi oluşturduk. Bu sistem bir PowerPoint sunumu ile larva gösterilir spontan davranış ve caydırıcı bir uyarana tepki, ölçer. Kaydedilen görüntüler, otomatik olarak renk kanalları böler bir ImageJ makro ile analiz edilir arka plan çıkarır ve şerit bireysel larva yerleştirme tanımlamak için bir eşik geçerlidir. Daha sonra yüzme hızı, sokağın kenarına ya da yan için tercih, dinlenme davranış, thigmotaxis, larva arasındaki mesafe ve kaçınma davranışı ölçmek için bir Excel sayfası içine koordinatları alabilirsiniz. Davranış ince değişiklikler kolayca çevresel toksik maddeler veya ilaçlara maruz kaldıktan sonra davranış analizleri için yararlıdır, bizim sistemi kullanılarak tespit edilir.

Giriş

Zebra balığı genetik, gelişimsel ve davranış bilimleri ^1-4 için popüler bir modeli haline gelmektedir. Bunlar, 2-3 gün sonra döllenme (DPF) kendi chorions gelen yumurtadan 4-5 dpf'e tarafından tam olarak işleyen bir organ geliştirmek ve 7 dpf ^5,6 ile davranışların çok sayıda sergiler. Balığı larvaları ideal nedeniyle küçük boyutu ^7,8 yüksek verimlilik analizler için uygundur. Yazılım larva ve yetişkin zebrabalıkları ^9-14 davranış otomatik analiz için ticari olarak temin edilebilir. Ancak bu yazılım pahalı ve çok iyi plakaları Zebra balığı larvalarının karmaşık davranışları ölçmek için sınırlı seçeneği vardır.

Biz kurmak ve 7 dpf Zebra balığı larvaları ^15,16 farklı davranışlar bir dizi sayısal olarak ucuz yeni bir yüksek verimli görüntüleme sistemi oluşturdu. Sistem, bir dizi embriyonik maruz kaldıktan sonra bize hızlı ve verimli bir şekilde ince bir davranış bozukluğu test etmeye imkan vermektedirilaç ve çevresel toksik atıkları ^16-18.

Sistem, kabin üstündeki evin bir dijital fotoğraf makinesi ahşap dolaplar, kullanılarak inşa edilmiştir. Kamera bir dizüstü bilgisayar ¹⁵ yukarı bakacak şekilde ekran yerleştirilir kabinin altına aşağı karşı karşıya. Zaman atlamalı görüntüleme şerit larvaların yerleştirme yakalamak için kullanılır. Larva laptop ekranın üst kısmında konumlandırılmış dört çok iyi veya çok şeritli plakalara kadar muhafaza edilebilir. Biz larva kenar (thigmotaxis) ^15,17 doğru uzaklaşıyor (kaçınma) ve yüzme cevap için caydırıcı bir uyarıcı olarak bir PowerPoint sunumu kullanın. Görüntüler otomatik makro, renk kanalları bölünmüş arka plan çıkarma ve bireysel larva tanımlamak için bir eşik uygulamak için kullanıldığı ImageJ alınır. Koordinatlar her resim her larva için listelenen ve kaçınma ve thigmota ölçmek için kullanabileceğiniz bir Excel dosyasına eklenebilirxis davranış, balık mesafe balık, hız ve dinlenme ¹⁶ miktarı yüzmek.

Protokol

1. Zebra balığı Embriyolar toplanması ve Larva Raising

1. "Sahte" çim (yeşil iplikten yapılmış) (Şekil 1) ile cam Pyrex yemekleri Zebra balığı embriyolarının toplamak için şafakta tankları içine yerleştirilir ve iki saat bırakılmalıdır. Embriyoları içeren cam yemekleri bir el süzgeç üzerine dökülür ve deiyonize su ile durulanmalıdır. Embriyolar daha sonra yumurta suda yetiştirilmelidir. Yumurta su iyonu giderilmiş su ve 0.25 mg / küf önleyici olarak kullanılır metilen mavisi, L Anında Okyanus, 60 mg / l içerir.
2. Da, bireysel deneye olduğu hipotezini bağlı olarak, embriyolar hemen veya toksik maddelerin ya da eczacılık ile geliştirme belirli aşamalarında tedavi edilebilir. Toksik ve eczacılık genelde DMSO'da çözündürülür (bir 1000 X konsantrasyonda) ve daha fazla yumurta su ortamı içinde doğrudan seyreltilmelidir.
3. Ilaç veya zehirli madde ile embriyonik ve larva tedavisi sırasındas, larva ve embriyolar 7 dpf (yumurta su çözeltisi iki günde en az bir bakteri / mantar üremesini önlemek için değiştirilmesi gerekir da davranışsal analiz sonu 50, ml başına yaklaşık 50-60 larva yoğunluğunda derin bir petri levhalar içinde muhafaza edilebilir ölü embriyolardan).

2. Davranış Analizleri için kalıplar hazırlanıyor

1. Özel x 7,6 cm x 5 mm içi-özel inşa edilmiş 11.7 cm boyutlarında plastik kalıpları geliştirdi. Kalıplar Thermo Scientific gelen tek iyi plastik tabak içine dökülür agaroz kullanarak şerit oluşturmak için gereklidir. Tek iyi plakaları ölçü 12,4 cm x 8,1 cm x 1,2 cm.
2. Kalıp kenarlarına 60 ° açılı olduğu beş şerit içerir. Kalıplara şerit alt genişlik 14 mm iken, en geniş olan en az 18 mm'lik bir baz ile yüksek bir 3.5 mm 'dir. Kalıp şerit (Şekil 2) arasında 4 mm boşluk vardır.
3. Şerit erimiş agaroz 50 ml (Deiyonize yılında% 0.8 agaroz dökün hazırlamak içinTek plaka 60 mg / L Anında Okyanusu) ile d su. Kalıp daha sonra herhangi bir kabarcık oluşumunu ortadan kaldırmak için sıvı agaroz üzerinde çok yavaş bir şekilde yerleştirilmesi gerekir ve (yaklaşık 45 dakika sürer) agaroz soğuduğunda kaldırılabilir.
4. Davranışsal deney (kurumasını agaroz önlemek için) şerit yaklaşık 36 saat için yemekleri kapaklı oda sıcaklığında saklanabilir çalıştırmak için önce agaroz şeritleri en erken bir daha gün yapılmalıdır. Agaroz şerit sadece bir deney için kullanılmalıdır ve atılmalıdır.

3. Görüntü Yakalama

1. En fazla 20 larva plakaların her şerit yerleştirilebilir. Hat başına tipik olarak 5 larva yüzmek hızı en doğru izleme kolaylaştırmak ve deney başına gereken larvaların sayısını azaltmak için kullanılır. Şeritli yumurta su ile veya deneme bağlı olarak ilaç veya toksik maddeler olmadan doldurulabilir. Bununla birlikte, şerit f olmamalıdıronlar görüntüleme dolaplar yerleştirilir kadar tüm yol kadar illed, bu taşma engeller. Onlar agaroz kalıpları yerleştirilir ve dizüstü bilgisayar ekranın üst kısmında konumlandırılmış sonra tutarlılık için, larva on dakika bir iklimlendirme dönemi olmalıdır. Verimli Petri kabı agaroz şeride larva hareket larva stresi azaltmaya yardımcı olacaktır. Larvaları sığ tanklarda veya Petri kapları yerleştirilmiştir, bu en kolay yoldur.
2. Görüntüleme dolapları zaman atlamalı fotoğraf ve bir dizüstü bilgisayar için kullanılan bir Canon dijital kamera yer alıyor. Kamera kabinin üst kısmında yer ve 15.6 inç ekranlı dizüstü bilgisayar ekranı (Şekil 3) yukarı bakacak şekilde yerleştirilmelidir kabinin altına doğru hedeflenmelidir. Dört plakaları doğrudan dizüstü bilgisayar ekranın üst kısmında elle yerleştirilmelidir. Bu (l kenarlarında gölgeler ortadan kaldırmak için sokağın üst seviyede olacak şekilde şu anda şerit yumurta su veya kimyasal tedavi ile kapalı tepesinde olabilirgörüntüler anestezi).
3. Bir PowerPoint sunumu larvaları için caydırıcı bir uyarıcı olarak kullanılır. Geçmiş hareketli kırmızı top 6 ya da 12 çok iyi plakaları ^15,17,18 larva balığı gösterilmiştir. Mevcut PowerPoint plakanın üst yarısının (Şekil 4) üzerinde hareket eden kırmızı renkli çubuk 15 dakika, ardından 15 dakika boyunca boş bir beyaz arka plan ile başlar. Larva aşırı ısınma ortadan kaldırmak için, bu 28 üzerinde gitmez bir ekran ° C ile bir dizüstü bilgisayar satın almak en iyisidir Agaroz şerit içinde sıvının buharlaşmasıyla önlemek için, maksimal görüntüleme zamanı bir saat altında tutulmalıdır.
4. Dijital fotoğraf makinesi Deneme başına 300 görüntü olmak üzere toplam resim her 6 saniye alarak, zaman atlamalı fotoğraf için programlanmalıdır. Ancak, frekans ve uzunluk ve davranışsal deney miktar bağlı olarak ayarlanabilir. Geçmişte uzun görüntüleme zamanlarda her resim arasında uzun aralıklarla kullanarak istihdam edilmiştir. CamerBir video hızı (saniyede 30 kare) de görüntüleme için daha düşük bir çözünürlükte ayarlanabilir. Düşük çözünürlüklü tek bir multiwell plaka için kayıtları sınırlar ise, video kayıtları görüntüleme hızlı yüzme olaylar ¹⁵ için uygundur.

4. Görüntü Analizi

1. Görüntüler ImageJ ile açıldı ve özellikle de içi yazılmış bir makro ile birlikte kullanılmalıdır. Makro otomatik olarak, kırmızı renk çıkarılabilir, böylece renk kanalları böler arka çıkarma, bir eşik uygular ve partikül analizi ile larvaları tanımlar. Beş şeritli larva analiz için en güncel makro Zebrafish_macro25k olduğunu. Görüntü sayısı, çıkarılabilir renk, görüntü eşiği, vb ayarlamak için makroda ister kullanın
2. Tüm görüntüleri ImageJ makro ile çalıştırmak sonra, bir sonuç dosyası görüntülenir ve x içerecek, y görüntü numarası ve şerit numarası ile birlikte her resim için tek tek larvaların koordine eder.
3. Sonuçlar dosya bir Excel biçiminde kaydedilir ve daha sonra boş bir arka plan vs hareketli bar arka plan ve kuyu sayısı dayalı tasnif edilmelidir. Excel şablonu otomatik olarak kuyularda larvaların yerleşimini belirler inşa denklemler, larva arasındaki mesafe, hareket hızı ve dinlenme miktarda olduğu kullanılmalıdır. En güncel Excel şablonu 25ib istek üzerine kullanılabilir olduğu, Créton laboratuvar oluşturulur. Farklı tedavi grubu gösteren grafikler tedavi grubu ve kontrol grubu arasında karşılaştırma için t-testi ile birlikte Excel sayfası içine inşa edilmelidir. Ayrıca istatistiksel analiz SPSS kullanılarak yapılabilir.

Sonuçlar

Daha önceki analizlerde, vahşi tip larva iyi (kaçınma davranışı) 'de yüzerek ve iyi (thigmotaxis davranış) ¹⁵ kenarlara doğru hareket topu cevap, top zıplatma caydırıcı uyarıcı tedavi olduğunu kullanarak. Daha sonra bu tahlilde thigmotaxis davranış zebrabalıkları larvaları ^17. Anksiyete ile ilgili bir davranış önlem olduğunu doğruladı. Boş bir beyaz arka karşılaştırıldığında larvaları hareketi önemli farklılıklar uzağa top ve kenar tercihi vardı. Bu davranışlar da hareketli kırmızı çubuk kullanarak yeni tahlil doğrulanmıştır ve daha güçlü ¹⁶ olan var. Ayrıca, şimdi yüzme hızı, dinlenme, iyi sonunda ya da yan için tercih, ve balık arasındaki mesafe (Şekil 5) de dahil olmak üzere tek bir deneyde davranışları daha çok sayıda örnek olabilir. Yumurta su yetiştirilen Kontrol larva artan bir tercih çanak ve sokağın kenarında bir aşağı olmak göstermekFrangoulis onlar caydırıcı bir uyaran (kırmızı çubuğu hareket) mevcuttur. Larva 1 ug / ml DMSO, yaygın olarak 1.000 x stok çözeltiler gibi çeşitli ilaç ve toksik maddeler çözmek için kullanılan bir çözücüyü içeren yumurta su yetiştirilen benzer sonuçlar elde edilmiştir.

Örnek sonuçlar yumurta su ve DMSO (kontrol olarak) ve genellikle organik olmayan besinlerde bulunan bir organofosfat pestisit değişen konsantrasyonları ile muamele edilmiş larvalarda Şekil 5 'de gösterilmiştir. Gösterilen sonuçlar, bir deneyde bir örnekleme. Ancak, tekrar, sonuçlar yüzme hızı ve thigmotaxis davranış insan gıdası tüketimi ¹⁸ düzeyleri taklit organofosfat pestisitlerin düşük konsantrasyonlarda, tarafından değiştirilmiş olduğunu gösterir.

Şekil 1. Koleksiyon Tepsiler. Cam Pyrex yemekleri e toplamak için kullanılıryetişkin balık tankları mbryos. Pyrex yemekleri kapakları kesilmiş ve plastik ızgaraları ve yeşil iplik plastik ızgaraları üzerine dikilir ile yerleştirildi. Bu doğal çevre taklit ederek yetişkin zebrafish için bir üreme ortamı oluşturur.

Şekil 2. Plastik kalıp ve agaroz şerit. A) kalıp solda gösterilir. % 0.8 agaroz tek plaka içine dökülür; kalıp yavaş yavaş eklenir ve agaroz soğuduğunda sonra kaldırılır B) sağ plakası plastik kalıp agaroz oluşturulan şerit gösterir..

Şekil 3,. Görüntüleme Dolaplar. Görüntüleme dolapları speciall edildiy Laboratuvarımızda inşa edilmiş ve yüksek verimli davranış analizleri için kullanılır. Bir 15 megapiksel dijital kamera, bir dizüstü ekranın üstüne yerleştirilir multilane plakalar larvaların zaman atlamalı görüntüleri toplamak için aşağı bakacak şekilde kabinin üst bağlıydı. Plakaları ve ekran arasında toplanan görüntüler hareli desenleri önlemek için kullanılan bir plastik difüzör var.

Şekil 4. Boş arka plan ve PowerPoint caydırıcı uyarıcı. Bu Zebra balığı larvaları davranış değişiklikleri uyandırmak için kullanılan geçerli PowerPoint. Bu A) boş bir arka plan ve B) hareketli kırmızı çubuk arasındaki sağlam davranış farklılıkları sağlar.

Şekil 5,. Yüksek verimli test Sayısallaştırılmış Davranışlar. Biz x, larva y koordinatları için kullandığınız Excel sayfası içinde bizim davranış testte sayısal vardır davranışların örneği. Beyaz bar boş bir arka plan maruz kalan ve kırmızı çubuklar PowerPoint kırmızı hareketli bar maruz larva verileri göstermek larva verileri göstermektedir. Grafikler) B, sokağın ucunda larva yüzdesi, C) sokağın kenarında larva yüzdesi, D) Mesafe arasındaki şeritte larvaların A) Yüzde aşağı davranış analizi elde edilebilir ölçümler göstermektedir balık (mm), E) larvaları (mm / dak), F) larvaların yüzdesi dinlenme hızı yüzün. Gösterilen grafiklerin, veri Tedavi danDMSO kontrolü ve 0.001 0.1 mcM (genellikle insan diyet bulundu düzeyleri) arasında değişen bir pestisit çeşitli konsantrasyonlarda larvaların ent. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Tartışmalar

Biz sürekli yeni davranış tahlil iyileştirilmesi olsa da, her zaman kaçınma ve Zebra balığı larvaları ¹⁵ thigmotaxis davranış tespiti için yararlı olmuştur. Pek çok çalışma, örneğin kullanılan uyarıcı renk olarak, tahlilin sonuçları optimize etmek için yapılmıştır, şerit başına larva ve davranış tahlilinde uzunluğunu doğru sayısı. Daha önce, çok iyi plakaları (6 ya da 12 kuyucuklu) ^15,17,18 kullanılır. Ancak, son zamanlarda bize tek bir deneyi ¹⁶ (Şekil 5) davranışsal önlemler daha çok sayıda toplamak için izin larvaları için daha büyük bir yüzme alanı oluşturmak için yeni şerit kalıp oluşturduk. Diğer değişiklikler PowerPoint işletmeler varyasyonları (testinin değişmiş hareket ya da uzunluk) ve (biz de daha dar yolları için kalıplar var) kullanılan şerit büyüklüğü içerir.

Şu anda, bu yüksek verimli otomatik sistem ZEBR davranışları geniş bir ürün yelpazesi ölçmek için yeteneği benzersizdirBu hız, kaçınma, diğer larva yakınlık ve çok şeritli plakalar thigmotaxis aynı zamanda Afish larva. Sonuçlar hızlı bir şekilde elde edilebilir ve larva, çok sayıda görüntüleme zamanda analiz edilebilir. Sistem kurmak için oluşturmak için ucuz ve hızlı ve kolay hem de. Bu sistemin bir sınırlama 3-D hareketleri Zebra balığı larvaları değerlendirilemez olmasıdır. Yetişkin Zebra balığı izlemek otomatik sistemler 3-Ge kapasitesi var ve bu hareket yukarı veya aşağı su sütunu ^10,19 içinde gibi davranışların daha geniş belirleyebilir. Başka bir sınırlama bizim görüntüleme sistemi şu anda görüntü hızda yüksek verimlilik analizleri için optimize olmasıdır. Daha düşük bir çözünürlük ¹⁵ için kamera ayarlarken video hızlı görüntüleme mümkündür, ama bu tek plaka için analiz kısıtlar.

Yeni oluşturulan "şerit" yöntemi kullanılarak, tahlil çeşitli yerlerinde hassas bir şekilde yürütülür gerekiyordu. T larvaları yerleştirirkeno şerit, bu plakalar laptop ekranın üst kısmında konumlandırılmış kadar sıvı seviyesinin çok sığ olduğundan emin olmak için önemlidir. Şerit sıvı çok dolu ise, larva plakanın çevresine kaçacak. Buna ek olarak, agaroz kalıbın, bakım zaman çok yavaş kalıp düşürmek için gerekli önlemler alınmalıdır. Kalıp çok hızlı takılırsa, kabarcıkları agaroz oluşturacak ve ek larva olarak Resim J makro tarafından tespit edilecektir. Bu agaroz şerit hatta birkaç kabarcıkları varsa, bu yenilerini yapmak için en iyi tavsiye edilir.

Gelecekte, bu tür Zebra balığı larvaları öğrenme gibi diğer karmaşık davranışları analiz ve öğrenme erken gelişiminde toksik ve ilaç maruz etkilenebilir nasıl incelemek için bizim davranış tahlil optimize etmek istiyorum. Şu anda davranışsal sonuçları beyin bölgeleri olduğu tespit kolaylaştırabilir hangi öğrenme davranışlarını analiz için yararlı olabilir testleri üzerinde çalışıyoruzgelişim sırasında bazı toksik maddeler veya ilaç etkilenir. Otomatik deneyleri Zebra balığı larvaları ²⁰ ve bu deneylerde davranışları öğrenme çok şeritli plakalar sağlam kaçınma tepkisi kullanarak yüksek verimli tarama için iyileştirilebilir olabilir ölçmek için geliştirilmiştir.

Bu davranış tahlilinde, ilaç ve toksik maddeler, çok sayıda gelişimsel etkilerini test etmek için daha sonraki çalışmalarda kullanılabilir öneriyoruz. Bu tür çalışmalar belirli risk faktörleri üzerine bilgi hazinesi sağlamak ve hamile kadınlar ve çocuklar için daha iyi sağlık ve güvenlik kurallarına ayar katkıda bulunacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Instant Ocean	That Pet Place	198262
Agarose	Fisher	BP1356-100
Methylene Blue	That Pet Place	214325
Equipment
One well plates	Fisher	12-565-493
Digital camera	Canon	EOS Rebel T1i
Imaging Cabinets	WoodCraft Towers
Laptops	Acer Aspire	Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.
Camera Lens	Canon	EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens
Plastic diffuser	Pendaflex	52345
Software
PowerPoint 2010	Microsoft
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/
Excel 2010	Microsoft
Statistical software	SPSS 20