Zebrafish의 유충에 자동으로 높은 처리량 행동 분석

요약

우리 연구실은 7 일 된 제브라 피쉬의 애벌레의 여러 가지 행동의 검출에 유용 소설 높은 처리량 자동화 이미징 시스템을 개발했다. 이 시스템은 유충이 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동의 미묘한 변화를 감지하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

우리는 다 차선 접시에 7 일짜리 zebrafish의 유충의 행동 분석을위한 새로운 높은 처리량 이미징 시스템을 만들었습니다. 이 시스템은 파워 포인트 프레 젠 테이션을 통해 유충에 표시됩니다 자발적 행동과 혐오 자극에 대한 반응을 측정합니다. 촬영 된 이미지는 자동으로 색상 채널을 분할 ImageJ에 매크로로 분석되는 배경을 뺀 차선의 개별 애벌레 위치를 식별하는 임계 값을 적용합니다. 우리는 그 수영 속도, 차선의 가장자리 또는 측면에 대한 선호, 휴식 행동, thigmotaxis, 유충 사이의 거리 및 회피 행동을 정량화하기 위해 엑셀 시트에 좌표를 가져올 수 있습니다. 행동의 미묘한 변화는 쉽게 환경 독성 물질이나 약품에 노출 된 후 행동 분석을위한 유용하고, 우리의 시스템을 사용하여 감지됩니다.

서문

제브라 피쉬는 유전 적, 발달 및 행동 과학 ^1-4 인기 모델이되고있다. 그들은 2-3 일 포스트 수정 (DPF)하여 chorions에서 부화 4-5 DPF에 의해 완벽하게 작동하는 기관을 개발하고, 7 DPF ^5,6에 의한 행동의 큰 숫자를 나타냅니다. Zebrafish의 유충은 이상적 때문에 그들의 작은 크기 ^7,8의 높은 처리량 분석에 적합합니다. 소프트웨어 애벌레와 성인 zebrafish의 ^9-14의 행동의 자동 분석을위한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 그러나,이 소프트웨어는 비싼 멀티 잘 접시에 zebrafish의 애벌레의 복잡한 행동을 측정하기위한 제한된 옵션이 있습니다.

우리가 설정하고 7 DPF의 zebrafish의 애벌레 ^15,16 다른 행동의 수를 정할 수있는 저렴 소설 높은 처리량 이미징 시스템을 만들었습니다. 시스템의 수에 배아 노출 후에 저희가 신속하고 효율적으로 미묘한 행동 이상을 테스트 할 수 있습니다제약 및 환경 독성 물질 ^16-18.

시스템 캐비닛의 상단에 집이 디지털 카메라 나무 캐비닛을 사용하여 만들어졌습니다. 카메라는 노트북이 ¹⁵ 위로 향하도록 화면 배치 캐비닛의 바닥에 아래로 직면 해있다. 시간 경과 영상은 차선 애벌레의 위치를​​ 캡처하는 데 사용됩니다. 애벌레는 노트북 화면의 상단에 위치하는 네 개의 멀티 잘 또는 다중 차선 번호판에 수납 할 수 있습니다. 우리는 애벌레의 가장자리 (thigmotaxis) ^{15,17쪽으로} 멀리 이동 (회피)와 수영 응답 혐오 자극으로 파워 포인트 프레 젠 테이션을 사용합니다. 이미지는 자동 매크로, 색상 채널을 분할 배경 빼기 및 개별 유충을 식별 할 수있는 임계 값을 적용하는 데 사용되는 ImageJ에로 가져올 수 있습니다. 좌표는 각 이미지의 각 유충에 대해 나열하고 우리가 회피 thigmota을 계량하는 데 사용 엑셀 파일에 삽입 할 수 있습니다XIS 행동, 물고기 거리는 물고기, 속도, 나머지 ¹⁶ 량을 수영.

프로토콜

1. 제브라 피쉬 배아의 수집 및 유충을 기르고,

1. "가짜"잔디 (녹색 원사에서 만든) (그림 1) 유리 파이렉스 요리 zebrafish의 배아를 수집하기 위해 새벽에 탱크에 삽입하고 두 시간 동안 남아있을 것이다. 배아를 포함하는 유리 접시는 소형 여과기에 부어 및 탈 이온수로 세척해야한다. 배아는 다음 달걀 물에서 재배되어야한다. 계란 물은 증류수 0.25 ㎎ / 곰팡이 억제제로 사용되는 메틸렌 블루의 L있는 인스턴트 오션 60 ㎎ / L를 포함합니다.
2. 각 실험의 가설에 따라, 배아는 즉시 또는 독성 물질이나 약품을 사용하여 개발의 특정 단계에서 처리 할 수​​ 있습니다. 독성 물질 및 의약품은 일반적으로 DMSO에 용해 (1,000 X의 농도)와 더 계란 물을 매체에 직접 희석해야한다.
3. 제약 또는 독성 물질과 배아와 애벌레 치료 중들, 유충 및 배아는 7 DPF (계란 물 솔루션이 매일 적어도 세균 / 곰팡이의 성장을 방지하기 위해 변경해야의 행동 분석까지 50 ML 당 50-60 유충의 밀도에 깊은 페트리 접시에 수납 할 수 있습니다 죽은 태아부터).

2. 행동 분석을위한 틀을 준비

1. 특히 X 7.6 cm X 5mm은 사내에서 - 사용자 지정 내장 된 11.7 cm를 측정 플라스틱 금형을 개발했다. 금형 온도 과학에서 하나의 잘 플라스틱 접시에 부어 아가을 사용하여 차선을 만드는 데 필요합니다. 하나의 웰 플레이트 측정 12.4 cm X 8.1 cm X 1.2 cm.
2. 금형면을 60 °로 각도되는 다섯 개의 차선을 포함합니다. 금형의 차선 밑바닥 폭이 14mm 인 반면 넓은입니다 상단에 18mm의 기본 높은 3.5 mm이다. 금형 레인 (그림 2) 사이의 4 개 mm 간격이 있습니다.
3. 차선이 녹은 아가로 오스의 50 ML (탈 이온화에서 0.8 % 아가로 오스를 부어 준비하려면하나의 웰 플레이트에 60 ㎎ / L 즉시 바다)와 D 물. 형은 그 어떤 거품 형성을 제거하는 액체 아가의 상단에 아주 천천히 배치해야하고 (약 45 분 소요)를 아가로 오스가 냉각 될 때 제거 할 수 있습니다.
4. 행동 실험 (건조 아가을 피하기 위해) 차선은 약 36 시간에 대한 접시에 뚜껑 실온에서 최대 저장할 수 있습니다 실행될 전에 아가 레인은 그 이전보다 하루하여야한다. 아가로 오스 차선은 하나의 실험에 사용되어야하고 폐기해야합니다.

3. 이미지 캡처

1. 최대 20 유충은 플레이트의 각 레인에 배치 할 수 있습니다. 레인 당 일반적으로 5 유충은 수영 속도의 가장 정확한 추적을 용이하게하고 실험마다 필요한 유충의 수를 줄이기 위해 사용됩니다. 레인은 계란 물이나 실험에 따라 의약품 또는 독성 물질없이 채울 수 있습니다. 그러나 차선 F 안된다그들은 이미징 캐비닛에 배치 될 때까지 모든 방법을 illed, 이것은 오버 플로우를 방지 할 수 있습니다. 그들은 아가로 오스 금형에 배치 노트북 화면의 상단에 배치 된 후 일관성을 위해 유충 10 분의 적응 기간을 가져야한다. 효율적으로 페트리 접시에서 아가로 오스 차선 애벌레를 이동하는 애벌레 스트레스를 줄이는 데 도움이됩니다. 애벌레가 얕은 탱크 또는 페트리 접시에 보관하는 경우 이것은 가장 쉬운 방법입니다.
2. 영상 캐비닛은 시간 경과 사진과 노트북에 사용되는 캐논 디지털 카메라 (가) 있습니다. 카메라가 캐비닛의 상단에 배치 15.6 인치 스크린 노트북은 화면 (그림 3)를 향하도록 배치되어야 캐비닛의 바닥을 향해 목표로해야한다. 4 판은 직접 노트북 화면의 상단에 손으로 위치해야합니다. 그것은 (L의 가장자리에 그림자를 제거하기 위해 차선의 상단 수준이되도록이 시간에 차선 계란 물 또는 화학 처리를 돌파 할 수있다이미지에 마취).
3. PowerPoint 프레 젠 테이션은 유충에 대한 혐오 자극으로 사용됩니다. 과거 이동 빨간 공 6 또는 12 멀티 웰 플레이트 ^{15,17,18에서} 애벌레 zebrafish의을 보여 하였다. 현재 파워 포인트 판의 위쪽 (그림 4)에 이동 빨간색 막대의 15 분 뒤에 15 분에 대 한 빈 흰색 배경으로 시작됩니다. 애벌레 과열 제거하기 위해서는 28 이상 이동하지 않는 화면 ℃의 온도로 노트북을 구입하는 것이 가장 좋습니다 아가로 오스 차선 내에서 액체의 증발을 방지하기 위해 최대 영상 시간을 한 시간 이하로 유지되어야한다.
4. 디지털 카메라는 실험 당 300 이미지의 총 사진마다 6 초 복용 시간 경과 촬영에 프로그래밍해야합니다. 그러나 주파수와 길이는 실험과 행동 정량화에 따라 조정할 수 있습니다. 과거의 확장 된 영상 시대에 각 이미지 사이에 더 이상 간격을 사용하여 채택되었다. camer를이 동영상 속도 (초당 30 프레임)에서 이미징을위한 낮은 해상도로 설정할 수 있습니다. 낮은 해상도는 하나의 다중 웰 플레이트에 녹음을 제한하는 동안, 비디오 녹화 이미징 빠른 수영 이벤트 ^15에 적합합니다.

4. 이미지 분석

1. 이미지는 ImageJ에 함께 열리고 특히 사내에서 작성되었습니다 매크로와 함께 사용되어야한다. 매크로가 자동으로 붉은 색을 제거 할 수 있도록 색상 채널을 분할 배경을 빼고 임계 값을 적용하고, 입자 분석하여 애벌레를 식별합니다. 다섯 차선 애벌레 분석을위한 가장 최신의 매크로 Zebrafish_macro25k입니다. 이미지의 개수, 차감 할 컬러, 이미지 임계 값 등을 설정하는 매크로 프롬프트를 사용하여
2. 모든 이미지는 ImageJ에 매크로를 실행 한 후 결과 파일이 표시되며 X가 포함됩니다, y는 이미지 번호와 레인 번호와 함께 각 이미지에 대한 개별 애벌레의 좌표.
3. 결과 파일은 엑셀 형식으로 저장 한 후 빈 배경 대 움직이는 바 배경도 수에 따라 정렬되어야합니다. Excel 서식 파일은 자동으로 우물 애벌레의 배치를 결정 내장 방정식, 유충 사이의 거리, 이동 속도, 나머지 금액을 가지고 사용되어야한다. 가장 최근의 엑셀 템플릿은 25ib 요청시 사용할 수있는, Creton 실험실에서 만들어집니다. 다양한 치료 그룹을 보여주는 그래프 치료 그룹과 통제의 비교를위한 t-테스트와 함께 엑셀 시트에 내장되어야한다. 또한 통계 분석은 SPSS를 사용하여 수행 할 수 있습니다.

결과

우리의 이전 분석에서, 야생형 유충은 잘 (회피 동작) 아래로 수영하고 잘 (thigmotaxis 동작) ^(15)의 가장자리쪽으로 이동하는 공에 응답 튀는 공 혐오 자극 치료되는 사용. 우리는 나중에이 분석에 thigmotaxis 문제가 zebrafish의 유충 ¹⁷ 불안 관련 행동의 측정을 확인 하였다. 빈 흰색 배경에 비해 애벌레의 움직임에 큰 차이 멀리 공을 가장자리 환경에서이 있었다. 이러한 동작은 움직이는 빨간색 막대를 사용하여 우리의 새로운 분석에서 확인 된 더욱 강력한 ^{16아르있다.} 또한, 우리는 지금 수영 속도, 휴식, 우물의 끝이나 측면에 대한 선호와 물고기 사이의 거리 (그림 5)를 포함하는 하나의 분석에서 행동의 큰 숫자를 맛보실 수 있습니다. 계란 물에 성장 제어 유충 증가 선호 요리와 차선의 가장자리에 다운하는 방법을 보여줍니다따고는 그들이 혐오 자극 (빨간색 막대를 이동)에 관한 정보들로 안내되게됩니다. 유충은 1 ㎍ / ㎖ DMSO, 일반적으로 1,000 X 주식 솔루션 등 다양한 의약품 및 독성 물질을 분해하는 데 사용되는 용매를 포함하는 계란 물에서 재배하는 경우 유사한 결과를 얻을 수 있습니다.

대표 결과는 계란 물과 DMSO (컨트롤)와 일반적으로 비 유기농 식품에서 발견 된 유기 인계 농약의 다양한 농도로 처리 유충의 그림 5에 표시됩니다. 같은 결과는 하나의 실험에서 샘플링입니다. 그러나 반복 할 때, 결과는 수영 속도와 thigmotaxis 동작이 인간의 음식 소비를 ¹⁸ 레벨을 모방 유기 인계 살충제의 낮은 농도로 변경되었음을 나타냅니다.

그림 1. 컬렉션 트레이. 유리 파이렉스 접시는 전자를 수집하는 데 사용됩니다성인 물고기 탱크에서 mbryos. 파이렉스 접시의 뚜껑을 잘라 플라스틱 그리드, 녹색 실이 플라스틱 격자에 놓은 된이 삽입되었다. 이 자연 환경을 모방하여 성인 zebrafish에 대한 번식 분위기를 연출합니다.

그림 2. 플라스틱 금형 및 아가 레인. A) 형은 왼쪽에 표시됩니다. 0.8 % 아가로 오스는 한 - 웰 플레이트에 붓고, 곰팡이가 천천히 삽입 아가로 오스가 냉각되면 다음 제거 B) 오른쪽의 플레이트 플라스틱 금형에 의해 아가 만든 차선을 보여줍니다..

그림 3. 영상 캐비닛. 이미징 캐비닛의 speciall했다y를 우리의 실험실에서 구축하고 높은 처리량 행동 분석에 사용됩니다. 15 메가 픽셀 디지털 카메라는 노트북의 화면 상단에 배치 다 차선 접시에 애벌레의 시간 경과 이미지를 수집하기 위해 아래를 향 캐비닛의 상단에 부착되었다. 접시와 화면 사이에 수집 된 이미지에 물결 무늬 패턴을 방지하기 위해 사용되는 플라스틱 디퓨저가있다.

그림 4. 빈 배경 및 PowerPoint 혐오 자극.이 zebrafish의 애벌레의 행동 변화를 연상하는 데 사용되는 현재의 파워이다. 그것은 A) 빈 배경 및 B) 이동 빨간색 막대 사이의 강력한 행동의 차이를 제공합니다.

그림 5. 높은 처리량 분석에서 정량화 된 행동. 우리는 X, 유충의 Y 좌표에 사용하는 엑셀 시트에서 우리의 행동 분석에서 정량화 행동의 예. 흰색 막대가 빈 배경에 노출 빨간색 막대는 PowerPoint에서 빨간색 이동 막대에 노출 된 유충에서 데이터를 표시 애벌레에서 데이터를 표시합니다. 그래프는) B, 차선의 끝에 유생의 백분율 C) 차선의 가장자리에 애벌레의 백분율 D) 거리 사이에 차선 유충) 비율 다운 행동 분석에서 얻을 수있는 측정을 나타냅니다 물고기 (mm), E)의 유충 (mm / 분), F) 유충의 백분율 나머지 속도를 수영. 그림 그래프, 데이터 트리트에서이다DMSO 제어 및 0.001에서 0.1 μM (일반적으로 인간의 식단에서 발견 된 수준)에 이르기까지 농약의 여러 농도의 유충 후 ENT. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

토론

우리는 지속적으로 새로운 행동 분석을 개선하는 동안, 그것은 항상 회피 zebrafish의 유충 ¹⁵ thigmotaxis 동작의 검출에 유용하고있다. 많은 시련이 같은 사용 자극의 색으로, 분석의 결과를 최적화하기 위해 수행되었다, 레인 당 유충, 행동 분석의 길이 이상적인 숫자입니다. 이전에, 우리는 멀티 웰 플레이트 (6 또는 12 우물) ^15,17,18를 사용했습니다. 그러나 최근에 우리는 우리가 하나의 분석 ¹⁶ (그림 5)의 행동 조치의 큰 숫자를 수집 할 수 있도록 유충 큰 수영 공간을 만들 수있는 새로운 차선 형을 만들었습니다. 다른 수정은 파워 포인트 예의 B의 변형 (분석의 변경 이동이나 길이) 및 (우리는 또한 더 좁은 골목길 금형을)를 사용 레인의 크기를 이용하실 수 있습니다.

현재이 높은 처리량 자동화 시스템은 zebr의 행동의 넓은 범위를 측정 할 수있는 고유 한 기능입니다같은 속도, 회피, 다른 애벌레에 근접, 멀티 레인 접시에 thigmotaxis과 동시에 afish의 애벌레. 결과를 신속하게 얻을 수 있으며 유충의 큰 숫자는 영상의 시간에 분석 할 수 있습니다. 시스템이 설정 구축 저렴하고 빠르고 쉽게 둘 수 있습니다. 이 시스템의 한계는 3-D 움직임 zebrafish의 유충에서 평가 할 수없는 것입니다. 성인 zebrafish의 추적 자동화 시스템은 3-D 기능을 가지고 있으며 이러한 이동 또는 아래로 물 열 ^{10,19에서와} 같은 행동의 넓은 범위를 식별 할 수 있습니다. 또 다른 한계는 우리의 이미징 시스템은 현재 비디오 속도에서 높은 처리량 분석을 위해 최적화되지 않는 것입니다. 낮은 해상도 ¹⁵ 카메라를 설정할 때 동영상 속도 이미징이 가능하지만,이 하나의 플레이트에 분석을 제한합니다.

새로 만든 "레인"방법을 사용하여, 분석의 여러 부분은 정확한 방법으로 실행해야 할 필요가 있었다. T의 유충을 배치 할 때그는 차선, 그것은 플레이트는 노트북 화면의 상단에 위치 할 때까지 액체의 수준이 매우 얕은 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 차선 액체의 너무 많이 있다면, 유충 판의 주변으로 탈출합니다. 또한, 아가로 오스에 금형을 삽입 할 때,주의가 매우 느리게 형을 낮추기 위해주의해야합니다. 형이 너무 빨리 넣으면 거품 아가 형성되고 추가 유충으로 이미지 J 매크로에 의해 식별됩니다. 그것은 아가로 오스 레인도 약간 거품이 있다면, 그것은 새로운 것들을 만들기 위해 최선 것이 좋습니다.

미래에, 우리는 zebrafish의 애벌레 학습 등의 복잡한 행동을 분석하고 학습이 초기 개발에 독성 물질 및 의약품에 노출에 의해 영향을받을 수있는 방법을 조사하기 위해 행동 분석을 최적화하고 싶습니다. 우리는 현재 행동 결과 뇌 영역을 결정할 촉진 할 수있는 학습 행동을 분석하는 데 유용 할 수 있습니다 분석에 노력하고 있습니다개발하는 동안 특정 독성 물질이나 약품에 의해 영향을 미쳤다. 자동화 된 분석은 zebrafish의 유충 ^(20)이 분석의 동작을 배우는 것이 다 차선 접시에 강력한 회피 반응을 사용하여 높은 처리량 검사를 위해 수정할 수있는 수 있습니다 측정하기 위해 개발되었습니다.

우리는이 행동 분석은 의약품 및 독성 물질의 다수의 발달 효과를 테스트하기 위해 미래 연구에 사용될 수 있다고 제안한다. 이러한 연구는 특정 위험 요소에 대한 풍부한 정보를 제공하고 임산부와 어린이를위한 더 나은 건강 및 안전 지침을 설정에 기여하는 것이다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Instant Ocean	That Pet Place	198262
Agarose	Fisher	BP1356-100
Methylene Blue	That Pet Place	214325
Equipment
One well plates	Fisher	12-565-493
Digital camera	Canon	EOS Rebel T1i
Imaging Cabinets	WoodCraft Towers
Laptops	Acer Aspire	Any is good as long as it has a 15.6 in. LCD screen with 1366 x 768 pixel resolution and a brightness of 220 cd/m2.
Camera Lens	Canon	EF-S 55 - 250 mm f/4.0 - 5.6 IS zoom lens
Plastic diffuser	Pendaflex	52345
Software
PowerPoint 2010	Microsoft
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/
Excel 2010	Microsoft
Statistical software	SPSS 20