הקמת דגם בניתוח מושרה בעכברים כדי לחקור את תפקיד מגן של progranulin בדלקת מפרקים ניוונית

Summary

אנו מתארים פרוטוקול ליציבות של המניסקוס המדיאלי מודל (DMM) בעכברים, כלי יעיל למחקר דלקת מפרקים ניוונית (OA). בנוסף, יש לנו הפגנו מחסור זה של פיתוח progranulincan להגזים OA והתקדמות באמצעות מודל זה, המציין כי progranulin משחק תפקיד מגן בפתוגנזה של OA.

Abstract

יציבות של המניסקוס המדיאלי מודל (DMM) הוא כלי חשוב ללימוד תפקידי pathophysiological של מולקולות דלקת פרקים רבות הקשורים בפתוגנזה של דלקת מפרקים ניוונית (OA) in vivo. עם זאת, מפורט, במיוחד הפרוטוקול דמיינו להקמת מודל מסובך זה בעכברים, אינו זמין. במסמך זה אנו ניצלנו wildtype וprogranulin (PGRN) - / - עכברים כדוגמאות להציג את פרוטוקול לגרימת מודל DMM בעכברים, ולעומת תחילתה של OA לאחר הקמת מודל מושרה בניתוח זה. הפעולות שבוצעו על עכברים היו או פעולת דמה, שנפתחה רק כמוסה משותפת, או בהפעלת DMM, אשר חתכה את רצועת menisco-השוקה וגרמה להתערערות של המניסקוס המדיאלי. חומרת דלקת מפרקים ניוונית הוערכה באמצעות assay היסטולוגית (למשל צביעת Safranin O), ביטויים של גנים הקשורים OA, צורת השפלה של מולקולות תאי מטריקס סחוס, וosteophyteation. פעולת DMM מושרה בהצלחה ייזום OA והתקדמות בשני wildtype וPGRN-/ - עכברים, ואובדן של גורם גדילת PGNR הוביל לפנוטיפ OA חמור יותר במודל מושרה בניתוח זה.

Introduction

דלקת מפרקים ניוונית (OA), המכונה גם דלקת פרקים ניוונית, משפיע 15% מאוכלוסיית העולם של ומעל 46 מיליון אנשים בתוך ארצות הברית, ומאופיין בדלקת, ניוון סחוס, והיווצרות osteophyte ^1. זה יכול להיות תוצאה של יחסי גומלין מורכבים של גורמים גנטיים, מטבולים, ביומכנית וביוכימיים. המנגנון הבסיסי של OA ימשיך להתחמק מהקהילה המדעית. קיימים כיום מודלים של בעלי חיים רבים שיכולים לחקות את הפתוגנזה של OA ^2,3. זה חשוב להקים מודלים של בעלי חיים בעכברים בגלל שתי הזמינות של עכברים מהונדסים גנטי שונים ועלות התועלת של ניסויים. בין סוגים שונים של מודלים OA ניסויים השונים, היציבות הנגרמת בניתוח של המניסקוס המדיאלי מודל (DMM) היא מודל OA היטב קיבל בגלל שחזור הטוב שלה והתקדמות איטית יחסית בפיתוח OA. שתי התכונות האלה יש ליהיה מפתח להערכת התקדמות OA בטיפולים שונים או transgenes ^3-8. עם זאת, העקביות של מודל OA כירורגית מושפעת מגורמים שונים במהלך הניתוח וכתוצאה מכך, היישום של מודל עכבר כירורגית מוגבל.

Progranulin (PGRN) הוא גורם גדילה רב תפקודי המתבטא בתאים שונים. זה ידוע כי PGRN משחק תפקיד קריטי בתהליכים פיסיולוגיים ומחלות שונים, כגון ריפוי פצעים ^9, tumorigenesis ^10, ודלקת ^11-15. מחקרים גם הראו כי אי ספיקה של PGRN יכולה לגרום למחל ניווניות של מערכת עצבים בבני האדם ועכברים ^16-18. זה ידוע כי PGRN בא לידי ביטוי בסחוס במפרק אנושי, ורמתו גבוהה באופן משמעותי בסחוס של חולים עם OA ודלקת מפרקים שגרונית ^19. בנוסף, PGRN גם ממלא תפקיד מכריע בהתפשטות הכונדרוציטים ^20, בידול וendochondralהתאבנות של צלחת צמיחה במהלך פיתוח ^21,22. לאחרונה, דיווח כי PGRN קומם TNF-α באמצעות קשירה לקולטנים TNF והציג פונקציה אנטי דלקתית במודלים של דלקת מפרקים דלקתיים ^13,14,23,24. עם זאת, תפקידיו של PGRN בOA, במיוחד in vivo, נותר חידה. בזאת, אנו מציגים את ההליך כדי לגרום למודל DMM כירורגית, ולחקור את התפקיד של PGRN בפיתוח OA באמצעות הקמת מודל DMM ב WT וPGRN-/ - עכברים.

Protocol

כל הניתוחים הקשורים לבעלי החיים צריכים להיות מאושר על ידי הטיפול בבעלי חיים ובועדת האתיקה של מוסד המקומי, עם מאמץ שנעשה כדי למזער את כאב ואי נוחות הנגרמת על ידי הניתוח.

1. הכנה

1. בחר C57BL / 6 עכברי זכרים 8-12 שבועות ישנים עם משקל גוף של כ 25 גרם לניתוח.
2. להרדים את בעלי החיים באמצעות זריקת intraperitoneal של קוקטייל המכיל גם xylazine (5 מ"ג / קילוגרם) וקטמין (40 מ"ג / קילוגרם).
3. לגלח את הברך עם סכיני גילוח, ולאחר מכן בניתוח לעטוף את בעלי החיים ולעקר את האתר כירורגית עם בטאדין ואלכוהול (3x) ולכסות את עיני עכבר עם משחה.

2. תהליך כירורגי

1. לעשות חתך para-patellar 1 סנטימטר אורך המדיאלי לחשוף את מפרק הברך.
2. פתח את מפרק הברך בעדינות דרך העקירה רוחב של הפיקה ורצועות פיקה.
   1. חותכים את קופסית מפרק הברך אורכיםדרך חתך para-הפיקה המדיאלי בשלב 2.1.
   2. לנתח קופסית מפרק הברך עם מלקחיים.
   3. תפוס את חלקו האחורי של כף רגל אחורית עם יד שמאל, ולבצע עקירה לרוחב של הפיקה ורצועות פיקה עם מלקחיים. החזק את כף הרגל האחורית בעדינות ולוודא כדי למנוע טראומה בכפה. טוב יותר קופסית המפרק מנותחת, יידרש פחות הכוח כדי להפוך את העקירה.
3. לטפטף מי מלח סטריליים על פני השטח של סחוס במפרק במהלך פעולה, כדי למנוע התייבשות של משטח סחוס.
4. לחתוך את רצועות meniscotibial המדיאלי המעגנת את המניסקוס המדיאלי לרמת השוקה. הימנע מפגיעה בסחוס מתחת המניסקוס המדיאלי.
   1. זהה את המניסקוס המדיאלי אשר מאתר בין condyle המדיאלי של עצם ירך ומישור המדיאלי של עצם השוק.
   2. זהה את רצועת meniscotibial שמחברת את הצד הלטרלי של המניסקוס המדיאלי עם רוממות intercondylar של שוקה.
   3. החזק את ההייnd כפה בעדינות עם יד, ולחתוך את רצועות meniscotibial המדיאלי בקפידה על ידי שימוש בלהב כירורגי מס 10. ודא שלא לגרום לפוצעים במפרק סחוס ורצועות אחרות. במקרים רבים, המכסה את כרית השומן צריכה להיות משכה לצד, אבל לא שיש להסירו על מנת לזהות את הרצועה.
5. סגור את קופסית מפרק הברך עם תפר נספג 6-0.
6. סגור את העור עם 6-0 תפר משי.

3. טיפול שלאחר ניתוח

1. תחול ירידה של bupivacaine 0.25% אחד באתר כירורגית של כל עכבר כדי למזער את הכאב שלאחר ניתוח.
2. השאר את העכברים פעלו בחינם כדי לקבל מים ומזון.

4. ניקוד היסטולוגית של דגם DMM כירורגי

1. להקריב את העכברים בנקודות שצוינו זמן (למשל 4 שבועות, 8 שבועות, ו12 שבועות. כאן אנו הראו תוצאות של 8 שבועות כנציג) לאחר הניתוח.
2. מפרקי הברך כולו הם קבועים, decalcified, לפdded ידי פרפין ולאחר מכן נותח באופן סדרתי ב5 מרווח מיקרומטר.
   1. חותכים את הגפיים אחוריות שלמים עם מס '10 להבים.
   2. לנתח את העור ושרירים של הגפיים האחורי בזהירות, ולתקן את הדגימות עם PFA 4% במשך 3 ימים בRT.
   3. הסר את PFA, ולנקות את הדגימות עם מים. לאחר מכן, decalcify הדגימות בEDTA על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות.
   4. מייבשים את הדגימות בשיפוע אתנול. בפירוט, לשמור את הדגימות באתנול 70% עבור שעה 1, ולאחר מכן לשנות את אתנול ולשמור את הדגימות בסט חדש של 70% אתנול לO / נ לאחר מכן, הכניס את הדגימות ב80% ו90% אתנול כתוצאה מכך, ולשמור אותם לשעה 1, בהתאמה, ואחריו אתנול 100% לO / נ
   5. הסר את אתנול. שמור את הדגימות בoxylene עבור שעה 1, ולעבור לקבוצה חדשה של oxylene. חזור 3x שלב זה.
   6. להטביע את הדגימות לתוך תבנית פרפין באמצעות מרכז הטבעה לייקה. לאחר מכן, הדגימות הם מחולק ב5 מיקרומטר באמצעות microtome סיבובי (לייקה RM2255, גרמניה) ולאחר מכן נאסף על גבי שקופיות זכוכית.
   7. סעיפי sagittal סידוריים נחתכים עבור כל דגימה פורש אזור ממרכז condyle לרוחב למרכז של condyle המדיאלי.
3. מכתים Safranin O מבוצע, ואחריו ניקוד וניתוח סטטיסטי באמצעות שיטת ניקוד OARSI כפי שתואר לעיל ^25.
   1. ראשית, deparaffinize השקופיות בoxylene, ומימה בשיפוע אתנול למים מזוקקים. לאחר מכן, הם מוכתמים השקופיות דרך ברזל Hematoxylin הפתרון של וייגרט, פתרון 0.05% ירוקים מהיר (FCF), 1% חומצה אצטית פתרון, ו0.1% O פתרון Safranin. הר השקופיות באמצעות מדיום שרף.
   2. ציון השקופיות המוכתמות Safranin O מבוסס על אובדן proteoglycan (צבע אדום) בסחוס ואחוז ההרס במבנה סחוס, לעשות ניתוח סטטיסטי לציון היסטולוגית.

תוצאות

מודל DMM הוקם בהצלחה בעכברים, וחסר של PGRN מוגזם פיתוח OA בניתוח מושרה.

פעולות דמה וDMM (איור 1) בוצעו ב WT וPGRN-/ - עכברים. 8 שבועות לאחר הניתוח, העכברים הוקרבו, ומכתים Safranin O בוצע על החלקים ממפרקי הברך, ואחרי ניתוח סטטיסטי ש?...

Discussion

הוא דיווח כי הזן של עכברים הוא חשוב מאוד לזירוז מודל DMM, זנים שונים כמו של עכברים דרגות חומרה שונים של OA אחרי DMM, עם הרמה הגבוהה ביותר במתח 129/SvEv, ואחריו C57BL6, 129/SvInJ ולאחר מכן FVB / n ^26. חלק גדול מtransgenes הוקם בעכברי C57BL6, כגון PGRN-/ - עכברים ששמשנו במחקר הנוכחי, שהם יחסית רגישי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
No. 10 Surgical blades	Feather	25-2976#10
6-0 suture	Applied Dental	WG-N53133