JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz farelerde medial menisküs (DMM) modeli, osteoartrit (OA) araştırma için etkili bir araç istikrarı bozacak bir protokol açıklar. Buna ek olarak, progranulin OA patogenezinde koruyucu bir rol oynadığını gösteren, bu model kullanılarak progranulincan fahiş OA gelişimi ve ilerlemesinde bu eksikliği göstermiştir.

Özet

Medial menisküs destabilizasyon (DMM) modeli, in vivo olarak, osteoartrit (OA) patojenezinde çeşitli artrit ilişkili moleküllerin patofizyolojik rolü incelemek için önemli bir araçtır. Bununla birlikte, detaylı, özellikle de farelerde bu karmaşık bir model kurmak için görsel protokol, mevcut değildir. Bu yazıda yabanitipte ve progranulin (PGRN) yararlandı - / - örnekler farelerde DMM modeli uyarılması için bir protokol ve bu cerrahiye bağlı modelin kurulması aşağıdaki OA karşılaştırıldığında başlangıcı tanıtmak gibi fareler. Fareler üzerinde yapılan işlemler sadece menisco-tibia ligament kesilir ve medial menisküs istikrarsızlaştırma neden eklem kapsülü veya DMM işlemi, açılan sahte işlem, ya da vardı. Osteoartrit şiddeti histolojik analizi (örneğin, Safranin O ile boyanmıştır) OA-ilişkili genlerin ifadesi, hücre dışı matris moleküllerinin kıkırdak bozulması ve osteofit formu kullanılarak değerlendirilmiştirtirme. Fareler ve bu cerrahiye bağlı modelinde daha şiddetli OA fenotipe yol PGNR büyüme faktörü kaybı - DMM işlemi başarıyla yabanitipte ve PGRN-/ hem OA başlamasını ve ilerlemesini bağlı.

Giriş

Ayrıca dejeneratif artrit olarak bilinen Osteoartrit (OA), dünya nüfusunun% 15 etkiler ve Amerika Birleşik Devletleri içinde 46 milyon fazla kişi ve sinovit, kıkırdak dejenerasyonu ve osteofit oluşumu 1 ile karakterizedir. Bu, genetik metabolik, biyomekanik ve biyokimyasal faktörlerin karmaşık etkileşimi sonucu olabilir. OA altında yatan mekanizmaları bilimsel topluluk kaçmasına devam ediyor. OA 2,3 patogenezi taklit edebilir çeşitli hayvan modelleri şu anda vardır. Çünkü çeşitli genetiği değiştirilmiş farelerin kullanılabilirliği ve deney maliyet etkinliği hem farelerde hayvan modelleri kurmak önemlidir. Deneysel OA modellerin farklı türde arasında, medial menisküs (DMM) modeli cerrahiye bağlı istikrarsızlaştırma çünkü onun iyi tekrarlanabilirlik ve OA gelişimi sırasında nispeten daha yavaş ilerlemesinin iyi kabul edilen OA modelidir. Bu özelliklerin her ikisi de varfarklı tedaviler veya transgenlerin 3-8 OA ilerlemesi değerlendirilmesi için önemli olmuştur. Ancak cerrahi OA modelin kıvamı ameliyat sırasında ve bir sonucu olarak çeşitli faktörler tarafından etkilenmektedir, cerrahi fare modelinin uygulama sınırlıdır.

Progranulin (PGRN), çeşitli hücrelerde ifade edilen çok fonksiyonlu bir büyüme faktörüdür. Bu PGRN yara iyileşmesi 9, tümör oluşumu 10, 11-15 ve enflamasyon gibi çeşitli fizyolojik ve hastalık süreçlerinde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Çalışmalar ayrıca PGRN yetersizliği, insan ve fareler 16-18 hem de sinir sisteminin dejeneratif hastalıklara neden olduğunu göstermiştir. Bu PGRN insan mafsal kıkırdağının eksprese olduğu bilinmektedir, ve seviyesi önemli ölçüde OA ve romatoid artrit 19 hastaların kıkırdağında yüksektir. Buna ek olarak, aynı zamanda PGRN kondrosit çoğalması 20, farklılaşması ve bölgelerinde ossifikasyonun de önemli bir rol oynargelişim sırasında 21,22 büyüme plağının kemikleşme. Son zamanlarda, PGRN TNF reseptörlerine bağlanma yoluyla TNF-α antagonize ve enflamatuvar artrit modellerinde 13,14,23,24 bir anti-inflamatuar işlevi sergilediğini rapor etmiştir. Ancak, OA PGRN rolü, özellikle in vivo, bir muamma olarak kalır. - Farelerde yazıda, cerrahi DMM modeli neden ve WT ve PGRN-/ in DMM modelini kurarak OA gelişiminde PGRN rolünü araştırmak için prosedürü sunuyoruz.

Protokol

Hayvanlara ilişkin tüm cerrahi prosedür ağrı ve cerrahinin neden rahatsızlığı en aza indirmek için yapılan bir çaba ile yerel Kurumun Hayvan Bakım ve Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması gerekir.

1.. Hazırlık

  1. Ameliyat için yaklaşık 25 g bir vücut ağırlığına sahip 8-12 haftalık erkek C57BL / 6 fareleri seçin.
  2. Ksilazin (5 mg / kg) ve ketamin (40 mg / kg) her ikisini de içeren bir kokteyl intraperitonal enjeksiyon yoluyla hayvanlara anestezisi.
  3. Jilet ile diz tıraş, sonra cerrahi drape hayvan ve betadin ve alkol (3x) ile cerrahi alan sterilize ve bir merhem ile fare gözleri kapsamaktadır.

2. Cerrahi Süreci

  1. Diz eklemi ortaya çıkarmak için 1 cm boyuna medial para-patellar kesi olun.
  2. Patella ve patellar ligamentin lateral çıkığı ile hafifçe diz eklemini açın.
    1. Uzunlamasına diz eklem kapsülü KesmeAdım 2.1 'de medial para-patellar kesiden.
    2. Forseps ile diz eklem kapsülü teşrih.
    3. Sol el ile arka ayak distal kısmını tut ve forseps ile patella ve patellar ligamentin lateral çıkığı gerçekleştirin. Yavaşça arka pençe tutun ve pençe travmayı önlemek için emin olun. Eklem kapsülü disseke daha iyi, daha az kuvvet çıkığı yapmak gerekecektir.
  3. Kıkırdak yüzeyinin kurumasını önlemek için işlem sırasında eklem kıkırdağı yüzeyinde steril tuzlu su Damla.
  4. Tibia plato medial menisküs çapa medial meniscotibial bağın kesebiliyor. Medial menisküs altındaki kıkırdak yaralanmasına kaçının.
    1. Femur medial kondil ve tibia medial platosu arasında bulur medial menisküs tespit.
    2. Tibia interkondiler itibar ile medial menisküs lateral tarafını bağlayan meniscotibial bağ tanımlayın.
    3. Hi tutunnd elinizle hafifçe pençe, ve 10 numaralı cerrahi bıçak kullanarak dikkatlice medial meniscotibial bağın kesti. Kıkırdak ve diğer bağ artiküler zarar neden değil emin olun. Birçok durumda, kaplama yağ yastığı tarafına çekilmesine ancak bağ tespit etmek amacıyla kaldırılması gerek yoktur.
  5. 6-0 emilebilir sütür ile diz eklem kapsülü kapatın.
  6. 6-0 ipek sütür ile cilt kapatın.

3. Post-operatif Bakım

  1. Ameliyat sonrası ağrı en aza indirmek için, her fare ameliyat bölgesinde% 0.25 bupivakain bir damla uygulanır.
  2. Su ve yiyecek almak için ücretsiz ameliyat fareler bırakın.

4. Cerrahi DMM Modelin histolojik Puanlama

  1. Belirtilen zaman noktalarında fareler kurban ameliyattan sonra (örneğin, 4 hafta, 8 hafta ve 12 hafta. Burada temsilcisi olarak 8 haftalık sonuçlar elde edilmiştir.)
  2. Tüm diz eklemleri, kireçlenmiş, embe sabitparafin ile dded ve daha sonra 5 um aralıklarla seri olarak kesit.
    1. No: 10 bıçaklarla bütün arka uzuvları kesilmiş.
    2. Dikkatlice arka bacaklarda cilt ve kasların incelemek, ve RT 3 gün boyunca% 4 PFA ile numunelerini sabitlemek.
    3. PFA çıkarın ve su ile örnekleri temizleyin. Daha sonra, 2 hafta boyunca 4 ° C'de EDTA içinde örnekleri kirecini.
    4. Bir etanol gradyanı içinde örnekleri kurutmak. Ayrıntılı olarak, daha sonra etanol değiştirebilir ve O / N için% 70 etanol içinde yeni bir dizi in örnekleri tutmak, 1 saat boyunca% 70 etanol içinde örnekleri tutmak Daha sonra,% 80 örnekleri koymak ve% 90 etanol dolayısıyla ve O / N% 100 etanol ile, ardından, sırasıyla 1 saat boyunca tutmak
    5. Etanol çıkarın. 1 saat için ksilen de örnekleri tutmak ve ksilen yeni bir dizi için değiştirin. Bu adım 3x tekrarlayın.
    6. Leica gömme merkezini kullanarak bir parafin kalıba örnekleri embed. Daha sonra, numuneler bir döner mikrotom (Leica RM225 ile 5 um'lik kesitler edilir5, Almanya) ve daha sonra cam slaytlar üzerine toplandı.
    7. Seri sagital kesitler kısım, orta kondilin merkezine lateral kondilin merkezi bir bölgeyi kapsayan her bir örnek için kesilir.
  3. Safranin O boyama, gerçekleştirilen önce 25 açıklandığı gibi OARSI skorlama sistemi ile puanlama ve istatistiksel analizi ile takip edilmektedir.
    1. İlk olarak, o-ksilen içinde slaytlar deparaffinize ve damıtılmış su, bir etanol gradyanı bunları hidrat. Bundan sonra, slaytlar WEIGERT Demir Hematoxylin Çözüm,% 0.05 Fast Green (FCF) Çözüm,% 1 asetik asit solüsyonu ve% 0.1 Safranin O Çözüm üzerinden lekeli. Reçineli orta kullanarak slaytlar monte edin.
    2. Histolojik skoru için istatistiksel analiz yapmak, kıkırdak ve kıkırdak yapısında yıkım yüzdesi proteoglycan'ın (kırmızı renk) kaybına dayalı Safranin O lekeli slaytlar Skor.

Sonuçlar

DMM model başarılı farelerde kurulan ve PGRN eksikliği cerrahi kaynaklı OA gelişimini abartılı oldu.

Fareler - Sham ve DMM işlemleri (Şekil 1) WT ve PGRN-/ gerçekleştirildi. 8 hafta ameliyat sonrası, fareler kurban edildi ve Safranin O lekeleme diz eklem bölümlerinde gerçekleştirilmiştir, histoloji göre artrit puanının istatistiksel analiz takip etmektedir. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, benzer temel koşulların?...

Tartışmalar

Bu farelerin suşu DMM modeli indüksiyonu için, farelerin farklı suşları / O C57BL6, 129/SvInJ ve FVB, ardından 129/SvEv gerginlik en yüksek seviyede, DMM sonra OA şiddeti değişen var çok önemli olduğu bildirilmektedir n 26. DMM nispeten duyarlı biz, bu çalışmada kullanılan fare, - transgenlerin büyük bir kısmı gibi PGRN-/ olarak C57BL6 farelerde kurulmuştur. Transgen tür FVB / N fareleri gibi hassas olmayan gerilme dayanan, ancak bu DMM indüksiyon öncesi duyarlı suşlar ile bu fare...

Açıklamalar

Biz burada biz herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH araştırma hibeleri R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210 ve (CJ Liu) Romatoloji Araştırma Vakfı Bir Hastalık Hedefli Araştırma Grant tarafından kısmen desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
No. 10 Surgical bladesFeather25-2976#10
6-0 sutureApplied DentalWG-N53133

Referanslar

  1. Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice. J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).
  2. Johnson, K., et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science. 336, 717-721 (2012).
  3. Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nat. Med. 16, 687-693 (2010).
  4. Glasson, S. S., et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature. 434, 644-648 (2005).
  5. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).
  6. Chia, S. L., et al. Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis. Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).
  7. Miller, R. E., et al. CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).
  8. Wang, Q., et al. Identification of a central role for complement in osteoarthritis. Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).
  9. He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
  10. Bateman, A., Bennett, H. P. The granulin gene family: from cancer to dementia. Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).
  11. Kessenbrock, K., et al. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
  12. Yin, F., et al. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
  13. Liu, C. J. Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis. FEBS Lett. , (2011).
  14. Tang, W., et al. The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice. Science. 332, 478-484 (2011).
  15. Zhu, J., et al. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
  16. Baker, M., et al. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
  17. Cruts, M., et al. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
  18. Wils, H., et al. Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice. J. Pathol. , (2012).
  19. Guo, F., et al. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
  20. Xu, K., et al. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
  21. Bai, X. H., et al. ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor. Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).
  22. Feng, J. Q., et al. Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).
  23. Liu, C. J., Bosch, X. Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target. Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).
  24. Wu, H., Siegel, R. M. Progranulin Resolves Inflammation. Science. 332, 427-428 (2011).
  25. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. a. n., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).
  26. Glasson, S. S. In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice. Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).
  27. Ma, H. L. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).
  28. Lin, A. C., et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).
  29. Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 84Farek k rdakCerrahiOsteoartritdejeneratif artritprogranulinmedial menisk s istikrars zla t rma DMM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır