変形性関節症におけるプログラの保護的役割を調査するためにマウスの外科的誘発モデルの確立

要約

我々は、マウスにおける内側半月（DMM）モデル、変形性関節症（OA）研究のための効果的なツールの不安定化のためのプロトコルを記述します。加えて、我々はプログラがOAの病因において保護的な役割を果たしていることを示す、このモデルを用いてprogranulincan誇張のOAの発症および進行の欠乏を示した。

要約

内側半月（DMM）モデルの不安定化は、 生体内での変形性関節症（OA）の発症に非常に多くの関節炎に関連する分子の病態生理学的役割を研究するための重要なツールです。しかし、マウスでは、この複雑なモデルを確立するための詳細な、特に可視化プロトコルは、使用できません。 - / - マウスではDMMモデルを誘導するためのプロトコルを導入する例として、マウス、およびこの外科的に誘発されたモデルの確立に続いて、OAの発症を比較して、ここに、我々は野生型およびプログラ（PGRN）を利用しました。マウスで実行された操作だけmenisco脛骨靭帯を切って内側半月の不安定化を引き起こし、関節包、またはDMMの操作を、開かれた偽手術、のいずれかであった。変形性関節症の重症度は、組織学的ア ​​ッセイ（ 例えばサフラニンO染色）、OA関連遺伝子の発現、軟骨の細胞外マトリックス分子の分解、および骨棘のフォームを用いて評価したATION。マウス、およびこの外科的に誘導されたモデルでは、より深刻なのOAの表現型につながっPGNR成長因子の損失 - DMM操作が正常に野生型およびPGRN - /の両方でのOA開始および進行を誘導した。

概要

また、変形性関節症として知られている変形性関節症（OA）は、世界の人口の15％、米国内4600万人以上の人々に影響を与え、滑膜炎、軟骨の変性、および骨棘形成¹によって特徴づけられる。それは、遺伝的な代謝、生体力学的および生化学的要因の複雑な相互作用の結果であり得る。 OAの基礎となるメカニズムは、科学界を回避し続けています。 ^2,3 OAの病因を模倣することができる多数の動物モデルが現在存在する。それがために、様々な遺伝子改変マウスの可用性および実験の費用対効果の両方のマウスにおいて、動物モデルを確立することが重要である。実験のOAモデルのさまざまな種類の中では、内側半月板（DMM）モデルの外科的に誘発される不安定化は、その良好な再現性やOA開発中に比較的遅く進行の広く受け入れられたOAモデルです。これらの属性の両方を持っているさまざまな治療法や導入遺伝子^3-8のOA進行を評価するための鍵となって。しかしながら、外科OAモデルの一貫性は、手術中に様々な要因によって影響され、その結果、外科用マウスモデルの適用が制限される。

プログラニュリン（PGRN）は、様々な細胞で発現多機能成長因子である。なお、PGRNは、創傷治癒^9、10腫瘍形成、および炎症^11-15のような種々の生理学的および疾患プロセスにおいて重要な役割を果たすことが知られている。研究はまた、PGRNの不足は、ヒトおよびマウスの両方において^16-18神経系の変性疾患を引き起こす可能性があることを示す。なお、PGRNは、ヒト関節軟骨において発現されることが知られており、そのレベルは有意にOA ¹⁹および慢性関節リウマチを有する患者の軟骨において上昇する。さらに、PGRNも軟骨細胞増殖^20、分化および軟骨性に重要な役割を果たしている開発^21,22の間の成長板の骨化。最近では、PGRNは、TNF受容体への結合を介して、TNF-α拮抗し、炎症性関節炎モデル^13,14,23,24において抗炎症機能を示すことを報告した。しかしながら、OAにおけるPGRNの役割は、特にインビボで 、謎のままである。ここで、我々は、外科DMMモデルを誘導するための手順を提示し、WTおよびPGRN - / DMMでモデルを構築を通してOA開発におけるPGRNの役割を調査 - マウス。

プロトコル

動物に関連する手術手順のすべては、手術による痛みや不快感を極力配慮の努力で、地元の機関の動物管理倫理委員会の承認を得なければならない。

1。準備

1. 手術のため、約25グラムの体重で8〜12週齢のオスのC57BL / 6マウスを選択します。
2. キシラジン（5 mg / kgの）およびケタミン（40 mg / kg）の両方を含むカクテルの腹腔内注射により動物に麻酔。
3. カミソリで膝を剃るし、外科的に動物をドレープし、ベータダイン及びアルコール（3×）で手術部位を消毒し、軟膏でマウスの眼をカバーしています。

2。外科的プロセス

1. 膝関節を露出させ1センチメートル縦内側パラ膝蓋骨切開する。
2. 膝蓋骨の横方向の脱臼と膝蓋靱帯を通してゆっくりと膝関節を開きます。
   1. 縦方向に膝関節包をカットステップ2.1の内側パラ膝蓋骨切開により。
   2. ピンセットで膝関節包を解剖。
   3. 左手で後肢の先端部をつかみ、そしてピンセットで膝蓋骨と膝蓋靭帯の横方向の転位を行う。優しく後肢を持って、足に外傷を避けるようにしてください。関節包を切開し、より良い、より少ない力が転位を行うために必要とされる。
3. 軟骨表面の乾燥を避けるために、動作中の関節軟骨の表面に滅菌生理食塩水を滴下する。
4. 脛骨プラトーに内側半月板を固定する内側meniscotibial靭帯を切断。内側半月の下に軟骨を痛めないようにしてください。
   1. 大腿骨の内側顆と脛骨の内側高原の間に位置内側半月板を特定します。
   2. 脛骨の顆間隆起と内側半月板の側面を接続meniscotibial靭帯を識別します。
   3. こんにちはを開催ND手で軽くPAW、及び第10外科用メスを使用して丁寧に内側meniscotibial靭帯を切断。関節軟骨や他の靭帯にけがの原因にならないことを確認してください。多くの場合、被覆脂肪パッド側に引っ張られる必要がなく、靭帯を同定するために除去されるべきではない。
5. 6-0吸収性縫合糸で膝関節包を閉じます。
6. 6-0絹縫合糸で皮膚を閉じます。

3。術後ケア

1. 術後の痛みを最小限に抑えるために、各マウスの手術部位に0.25％ブピバカインの一滴を適用する。
2. 水や食料を得るために自由に操作したマウスを残す。

4。外科DMMモデルの組織学的スコアリング

1. 示された時点で、マウスを生け贄に捧げる手術後（ 例えば 4週間、8週間、12週間。ここでは、代表として8週間の結果を示した）。
2. 全体膝関節は、脱灰​​し、embe固定されているパラフィンでddedしてから5ミクロン間隔で連続的に切断した。
   1. 第10ブレードを全体後肢を切った。
   2. 慎重に後肢の皮膚や筋肉を解剖し、RTに3日間、4％PFAでサンプルを固定します。
   3. PFAを外し、水でサンプルを清掃してください。その後、2週間、4℃で、EDTAのサンプルを脱灰。
   4. エタノール勾配でサンプルを脱水する。具体的には、エタノールを変更するO / Nの70％エタノールの新しいセット内のサンプルを維持、1時間70％エタノール中でサンプルを保つその後、結果として80％および90％エタノールに試料を入れて、O / Nを100％エタノール、続いて、それぞれ、1時間に残し
   5. エタノールを除去。 1時間o-キシレン中のサンプルを保持し、o-キシレンの新しいセットに変更します。このステップ3回繰り返します。
   6. ライカ埋め込むセンターを使用してパラフィン型の中にサンプルを埋め込む。その後、試料を回転式ミクロトーム（ライカRM225を使用して5μmに区画され、5、ドイツ）、次いでガラススライド上に集めた。
   7. シリアル矢状セクションは内側顆の中心に外側顆の中心から領域に及ぶ各サンプルのために切断されています。
3. サフラニンO染色は、以前に行わ²⁵記載のようにOARSI採点システムを介して採点し、統計分析が続く。
   1. まず、o-キシレン中でスライドを脱パラフィンし、蒸留水に対するエタノールの勾配でそれらを水和する。その後、スライドをワイゲルト鉄ヘマトキシリン​​溶液、0.05％ファストグリーン（FCF）溶液、1％酢酸溶液、および0.1％サフラニンO溶液を介して染色する。樹脂製のメディアを使用してスライドをマウントします。
   2. 組織学的スコアの統計分析を行う、軟骨と軟骨構造の破壊の割合のプロテオグリカン（赤色）の損失に基づいてサフラニンO染色スライドのスコア。

結果

DMMモデルが正常マウスに設立され、PGRNの欠乏は外科的に誘発されるOAの開発を誇張した。

マウス-偽とDMMの操作（ 図1）は 、WTおよびPGRN - /で行った。 8週間運転した後、マウスを屠殺し、サフラニンO染色は、組織学に基づいて、関節炎スコアの統計的分析、続いて、膝関節の切片上で実施した。 図2Aに示すように、同様のベースラ?...

ディスカッション

これは、マウスの異なる株はC57BL6、129/SvInJ、その後FVB続く、129/SvEv株では最高レベルで、DMMの後にOAの重症度を変化させてきたようにマウスの系統は、DMMモデルの誘導のために非常に重要であることが報告されている/ N ^26。 DMMに比較的影響を受けやすい我々は本研究で使用したマウス、 - 導入遺伝子の大部分は、PGRN - /などのC57BL6マウスで確立されている。導入遺伝子は、このよう?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
No. 10 Surgical blades	Feather	25-2976#10
6-0 suture	Applied Dental	WG-N53133