Estabelecimento de um modelo induzida cirurgicamente em ratos para investigar o papel protetor do Progranulin em Osteoartrite

Resumo

Nós descrevemos um protocolo para a desestabilização do menisco medial modelo (DMM) em camundongos, uma ferramenta eficaz para a osteoartrite (OA) de pesquisa. Além disso, temos demonstrado que a deficiência de exagerar desenvolvimento OA progranulincan e progressão usando esse modelo, indicando que progranulin desempenha um papel protetor na patogênese da OA.

Resumo

Desestabilização do menisco medial (DMM) modelo é uma importante ferramenta para estudar os papéis fisiopatológicos da artrite inúmeras moléculas associadas na patogênese da osteoartrite (OA) in vivo. No entanto, o pormenorizada, especialmente o protocolo visualizado para o estabelecimento deste modelo complicado em ratinhos, não está disponível. Aqui aproveitamos tipo selvagem e progranulin (PGRN) - / - ratos como exemplos para introduzir um protocolo para a indução do modelo DMM em camundongos, e comparou o início da OA após o estabelecimento deste modelo induzida cirurgicamente. As operações realizadas em ratos eram ou operação simulada, que acaba de abrir cápsula articular, ou operação DMM, que cortou o ligamento menisco-tibial e causou desestabilização do menisco medial. Osteoartrite gravidade foi avaliada utilizando o ensaio histológico (por exemplo, coloração de Safranina O), manifestações de genes OA-associados, a degradação de cartilagem moléculas de matriz extracelular, e forma de osteófitosção. Operação DMM induzida com sucesso a iniciação e progressão da OA em tanto o tipo selvagem e PGRN-/ - ratinhos, e a perda de factor de crescimento PGNR levou a um fenótipo OA mais grave neste modelo induzido cirurgicamente.

Introdução

A osteoartrite (OA), também conhecida como artrite degenerativa, afeta 15% da população mundial e mais de 46 milhões de pessoas nos Estados Unidos, e é caracterizada por sinovite, degeneração da cartilagem e formação de osteófitos ^1. Ele pode ser um resultado de uma interacção complexa de factores genéticos, metabólicos, bioquímicos e biomecânicos. Os mecanismos subjacentes da OA continuar a iludir a comunidade científica. Existem atualmente vários modelos animais que podem imitar a patogênese da OA ^2,3. É importante estabelecer modelos animais em ratos por causa tanto da disponibilidade de vários ratinhos geneticamente modificados e a relação custo-eficácia da experimentação. Entre os diferentes tipos de modelos experimentais de OA, a desestabilização induzida cirurgicamente de menisco medial modelo (DMM) é um modelo bem aceite OA por causa da sua boa reprodutibilidade e uma progressão relativamente lenta durante o desenvolvimento de OA. Ambos os atributos têmsido importantes para a avaliação de progressão da OA em diferentes tratamentos ou transgenes ^3-8. No entanto, a consistência do modelo OA cirúrgica é afetada por vários fatores durante a cirurgia e, como resultado, a aplicação do modelo cirúrgico do mouse é limitado.

Progranulin (PGRN) é um factor de crescimento multi-funcional expressa em várias células. Sabe-se que PGRN desempenha um papel crucial em diversos processos fisiológicos e patológicos tais como cicatrização de feridas ^{9, 10} tumorigénese, e inflamação ^11-15. Estudos também mostraram que a insuficiência de PGRN pode causar doenças degenerativas do sistema nervoso, em seres humanos e ratinhos ^16-18. Sabe-se que PGRN é expresso na cartilagem articular humana, e o seu nível é significativamente elevado na cartilagem dos pacientes com OA e de artrite reumatóide ^19. Além disso, PGRN também desempenha um papel fundamental na proliferação de condrócitos ^20, diferenciação e endocondralossificação da placa de crescimento durante o desenvolvimento ^21,22. Recentemente, informamos que PGRN TNF-α antagonizou através da ligação a receptores de TNF e exibiu uma função anti-inflamatória em modelos de artrite inflamatória ^13,14,23,24. No entanto, o papel de PGRN na OA, especialmente in vivo, continua a ser um enigma. Aqui, apresentamos o procedimento para induzir um modelo DMM cirúrgico, e investigar o papel do PGRN no desenvolvimento OA através do estabelecimento de modelo DMM no WT e PGRN-/ - ratos.

Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos relativos aos animais devem ser aprovados pelo Animal Care e Comitê de Ética da Instituição local, com um esforço feito para minimizar a dor eo desconforto causado pela cirurgia.

1. Preparação

1. Escolha de 8-12 semanas de idade macho C57BL / 6 com um peso corporal de cerca de 25 g para a cirurgia.
2. Anestesiar os animais por meio de injecção intra-peritoneal de um coquetel contendo tanto xilazina (5 mg / kg) e cetamina (40 mg / kg).
3. Raspar o joelho com lâminas de barbear, então armar cirurgicamente o animal e esterilizar o local da cirurgia com betadine e álcool (3x) e cobrir os olhos do rato com pomada.

2. Processo cirúrgico

1. Faça de 1 cm longitudinal medial para-patelar incisão para expor articulação do joelho.
2. Abra a articulação do joelho suavemente através de deslocamento lateral da patela e do ligamento patelar.
   1. Corte a cápsula articular do joelho longitudinalmenteatravés da incisão medial para-patelar no passo 2.1.
   2. Dissecar joelho cápsula articular com uma pinça.
   3. Pegue a parte distal da pata traseira com a mão esquerda, e realizar o deslocamento lateral da patela e do ligamento patelar com uma pinça. Segure a pata traseira com cuidado e certifique-se de evitar o trauma na pata. O melhor da cápsula articular é dissecado, menos força será necessária para fazer o deslocamento.
3. Gotejamento salina estéril na superfície da cartilagem articular durante o funcionamento, para evitar a secagem da superfície da cartilagem.
4. Corte através do ligamento medial meniscotibial que ancora menisco medial do platô tibial. Evite ferir a cartilagem sob o menisco medial.
   1. Identificar o menisco medial, que localiza entre côndilo medial do fêmur e platô medial da tíbia.
   2. Identificar o ligamento meniscotibial que liga face lateral do menisco medial com eminência intercondilar da tíbia.
   3. Segure o oiª pata suavemente com a mão, ea atravessar o ligamento medial meniscotibial cuidadosamente usando uma lâmina cirúrgica n º 10. Certifique-se de não causar ferir a cartilagem articular e outros ligamentos. Em muitos casos, a almofada de gordura de cobertura tem de ser puxado para o lado, mas não para ser removida, a fim de identificar o ligamento.
5. Feche a cápsula articular do joelho com uma sutura absorvível 6-0.
6. Feche a pele com seda 6-0.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Aplique uma gota de bupivacaína a 0,25% no sítio cirúrgico de cada rato para minimizar a dor pós-operatória.
2. Deixe os ratos operados livre para conseguir água e comida.

4. Scoring histológica da Surgical Modelo DMM

1. Sacrificar os ratos em pontos indicados tempo (por exemplo, quatro semanas, 8 semanas e 12 semanas. Aqui nós mostramos os resultados de oito semanas como representante) após a cirurgia.
2. As articulações do joelho são inteiros fixos, descalcificadas, embedded por parafina e seccionados em série no intervalo de 5 um.
   1. Cortar toda a membros posteriores com No. 10 lâminas.
   2. Dissecar a pele e músculos dos membros posteriores com cuidado, e fixar as amostras com PFA 4% para 3 dias em RT.
   3. Retire a PFA, e limpar as amostras com água. Posteriormente, as amostras descalcificar em EDTA a 4 ° C durante 2 semanas.
   4. Desidratar as amostras em um gradiente de etanol. Em detalhe, manter as amostras em etanol 70% por 1 hora, em seguida, mudar o etanol e manter as amostras em um novo conjunto de 70% de etanol para O / N. Em seguida, colocar as amostras de 80% e etanol a 90%, por conseguinte, e mantê-los durante 1 hora, respectivamente, seguido de etanol a 100% para S / N.
   5. Remover o etanol. Mantenha as amostras em oxylene por 1 hora, e mudar para um novo conjunto de oxylene. Repita este passo 3x.
   6. Incorporar as amostras em um molde de parafina utilizando o centro incorporar a Leica. Em seguida, as amostras são seccionados a 5 mM usando um micrótomo rotativo (Leica RM2255, Alemanha) e, em seguida, recolhidos em lâminas de vidro.
   7. Sagitais em série são cortados de cada amostra medindo a região a partir do centro do côndilo lateral para o centro do côndilo medial.
3. Safranina O coloração é realizada, seguida pela pontuação e análise estatística por meio do sistema de pontuação OARSI como descrito previamente ^25.
   1. Em primeiro lugar, Retire a parafina os slides em oxylene e hidratá-los em um gradiente de etanol para água destilada. Depois disso, as lâminas são coradas através de hematoxilina de ferro de Weigert solução, de 0,05% Fast Green (FCF) solução, solução de ácido acético a 1%, e 0,1% de Safranina O Solução. Montar as lâminas utilizando meio resinoso.
   2. Marque as lâminas coradas safranina O baseados em perda de proteoglicanos (cor vermelha) na cartilagem e porcentagem de destruição na estrutura da cartilagem, fazer uma análise estatística para o escore histológico.

Resultados

Modelo DMM foi estabelecida com sucesso em camundongos, e deficiência de PGRN exagerado desenvolvimento OA induzida cirurgicamente.

Operações Sham e DMM (Figura 1) foram realizadas em WT e PGRN-/ - ratinhos. 8 semanas após a operação, os ratos foram sacrificados, e Safranina O coloração foi realizada em secções de articulações do joelho, seguido de análise estatística da pontuação de artrite, com a histologia. Como mostrado na Figura ...

Discussão

É relatado que a linhagem de ratos é muito importante para a indução do modelo DMM, com diferentes linhagens de camundongos têm diferentes gravidade da OA após DMM, com alto nível na cepa 129/SvEv, seguido por C57BL6, 129/SvInJ e FVB / n ^26. Uma grande parte dos transgenes são estabelecidos em ratos C57BL6, como PGRN-/ - ratos foram utilizados no presente estudo, que são relativamente suscetíveis a DMM. No entanto, se o transgene é baseado na estirpe insensível como FVB / n murganhos, é necessár...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
No. 10 Surgical blades	Feather	25-2976#10
6-0 suture	Applied Dental	WG-N53133