Создание вызванной хирургически, модели у мышей по расследованию защитную роль Progranulin в остеоартрита

Резюме

Мы опишем протокол для дестабилизации медиального мениска (DMM) модели у мышей, эффективный инструмент для остеоартрит (ОА) исследований. Кроме того, мы продемонстрировали, что дефицит progranulincan развития преувеличивать О.А. и прогрессирования, используя данную модель, указывая, что progranulin играет защитную роль в патогенезе ОА.

Аннотация

Дестабилизация медиального мениска (DMM) модель является важным инструментом для изучения патофизиологических роли многочисленных артрита, связанных молекул в патогенезе остеоартрита (ОА) в естественных условиях. Тем не менее, подробный, особенно визуализируются протокол для установления этой сложной модели у мышей, не доступен. Здесь мы воспользовались дикого типа и progranulin (PGRN) - / - мыши в качестве примеров по внедрению протокола для индукции DMM модель на мышах, и по сравнению начало ОА следующий создания этого хирургически индуцированной модели. Проведенные на мышах операции были либо обман операция, которая только что открыл суставной капсулы, или операцию DMM, который разрезать menisco-большеберцовой связки и вызвало дестабилизацию медиального мениска. Тяжесть Артроз оценивали с помощью гистологического анализа (например, окрашивания Сафранин О), выражения ОА-связанных генов, деградация хряща молекул внеклеточного матрикса, и остеофит формыAtion. Операция DMM успешно индуцированных О.А. инициации и прогрессировании и в дикого типа и PGRN-/ - мышей, и потери фактора роста PGNR привело к более тяжелым ОА фенотипа в этом хирургически индуцированной модели.

Введение

Остеоартрит (ОА), также известный как дегенеративный артрит, влияет 15% населения земного шара и более 46 миллионов человек в Соединенных Штатах, и характеризуется синовита, дегенерации хряща, и формирование остеофитов ^1. Это может быть результатом сложного взаимодействия генетических, метаболических, биомеханических и биохимических факторов. Основные механизмы ОА продолжают уклоняться научное сообщество. Есть в настоящее время многочисленные животные модели, которые могут имитировать патогенеза ОА ^2,3. Важно установить животные модели у мышей как из-за наличия различных генетически модифицированных мышей и экономической эффективности экспериментов. Среди различных видов экспериментальных моделях О.А., хирургически индуцированной дестабилизация медиального мениска (DMM) модели является хорошо принят О.А. модель из-за его хорошей воспроизводимости и относительно медленным прогрессированием во время развития ОА. Оба этих атрибутов естьбыл ключевым для оценки прогрессирования ОА в различных обработок или трансгенов ^3-8. Тем не менее, последовательность хирургического модели ОА зависит от различных факторов, во время операции и в результате, применение хирургического мышиной модели ограничена.

Progranulin (PGRN) является многофункциональным фактор роста выражается в различных клетках. Известно, что PGRN играет важную роль в различных физиологических и болезненных процессов, таких как заживление ран ^{9, 10,} опухолей и воспалений ^11-15. Исследования также показали, что недостаточность PGRN может вызвать дегенеративные заболевания нервной системы у человека и мышей ^16-18. Известно, что PGRN выражается в человеческой суставного хряща, и его уровень значительно выше у хряща пациентов с ОА и ревматоидный артрит ^19. Кроме того, PGRN также играет важную роль в пролиферации хондроцитов ^20, дифференциации и Эндохондральныйокостенение роста пластины в процессе разработки ^21,22. Недавно мы сообщали, что PGRN против себя TNF-α посредством связывания с рецепторами TNF и выставлены противовоспалительное функцию в воспалительных моделей артрита ^13,14,23,24. Тем не менее, роль PGRN при ОА, особенно в естественных условиях, остается загадкой. Здесь мы представляем процедуру, чтобы вызвать хирургическую модель DMM, и исследовать роль PGRN в развитии ОА путем создания DMM модель в WT и PGRN-/ - мышей.

протокол

Все хирургических процедур, связанных с животными должно быть одобрено по уходу за животными и Этического комитета местного Учреждения, с усилием, чтобы свести к минимуму боль и дискомфорт, вызванный хирургии.

1. Подготовка

1. Выбор 8-12 недель самцов C57BL / 6 мышей с массой тела примерно 25 г в течение операции.
2. Обезболить животных через внутрибрюшинной инъекции коктейля, содержащего как ксилазина (5 мг / кг) и кетамин (40 мг / кг).
3. Бритье колено с бритвами, то хирургически драпировать животное и стерилизовать хирургические сайт бетадином и алкоголя (3х) и закрывала глаза мыши мазью.

2. Хирургическое Процесс

1. Сделать 1 см продольный медиальной пара-надколенника разрез выставить коленного сустава.
2. Откройте коленного сустава мягко через боковой вывих коленной чашечки и связки коленной чашечки.
   1. Разрежьте коленного сустава капсула продольночерез медиальной пара-надколенника разрез в шаге 2.1.
   2. Проанализируйте коленного сустава капсулу щипцами.
   3. Захватите дистальной части задней лапы с левой стороны, а также выполнять боковую вывих коленной чашечки и связки коленной чашечки щипцами. Держите заднюю лапу мягко и убедитесь, чтобы избежать травмы в лапы. Чем лучше суставная капсула рассечена, тем меньше сила будет обязан сделать дислокацию.
3. Капельное стерильный физиологический раствор на поверхности суставного хряща в процессе работы, чтобы избежать высыхание поверхности хряща.
4. Разрезать медиальной meniscotibial связка, которая прикрепляет медиального мениска на плато большеберцовой кости. Избегайте ранив хрящ по дну медиального мениска.
   1. Определить медиального мениска, который находится между медиального мыщелка бедренной кости и медиальной плато большеберцовой кости.
   2. Определить meniscotibial связки, которая соединяет боковой стороны медиального мениска с межмыщелковой возвышения большеберцовой кости.
   3. Держите приветй лапать осторожно стороны, и прорезать медиальной meniscotibial связки тщательно, используя номер 10 хирургического лезвия. Убедитесь в том, чтобы не вызвать ранение в суставном хряще и других связок. Во многих случаях, охватывающих жировой ткани должна быть потянул в сторону, но не должен быть удален с целью выявления связки.
5. Закройте коленного сустава капсула с 6-0 рассасывающиеся нити.
6. Закройте кожу 6-0 шелковой нити.

3. Послеоперационный уход

1. Применить одну каплю 0,25% бупивакаина в хирургическом месте каждой мыши, чтобы минимизировать послеоперационные боли.
2. Оставьте действовали мышей бесплатно, чтобы получить воду и еду.

4. Гистологическое Заброшенные хирургической DMM модели

1. Жертвоприношение мышей в указанные моменты времени (например, 4 недели, 8 недель и 12 недель. Здесь мы показали результаты 8 недель в качестве представителя) после операции.
2. Весь коленные суставы фиксированы, Декальцинированное, embedded парафином, а затем разрезали серийно на 5 интервале мкм.
   1. Разрежьте целые задние конечности с п. 10 лопастей.
   2. Проанализируйте кожу и мышцы задних конечностей тщательно, и исправить образцы с 4% PFA в течение 3 дней в РТ.
   3. Снимите PFA, и очистите образцы с водой. После этого образцы декальцинировать в ЭДТА при 4 ° С в течение 2 недель.
   4. Обезвоживают образцов в этаноле градиента. Более подробно, сохранить образцы в 70% этаноле в течение 1 часа, а затем изменить этанола и сохранить образцы в новый набор из 70% этанола в O / N. После этого положить образцов в 80% и 90% этанола, следовательно, и держать их в течение 1 часа, соответственно, с последующим 100% этанола для O / N.
   5. Снимите этанол. Держите образцов в oxylene в течение 1 часа, и перейти к новому набору oxylene. Повторите этот шаг 3 раза.
   6. Вставить образцов в парафиновой плесени с помощью вложение центр Leica. После этого образцы разрезали на 5 мкм с использованием роторного микротома (Leica RM2255, Germany) и затем собирали на предметных стеклах.
   7. Последовательные сагиттальных срезов разрезают для каждого образца, охватывающей область от центра латеральный до центра медиального мыщелка.
3. Окрашивание Сафранин О выполняется, а затем забил и статистического анализа через OARSI балльной системе, как описано выше ^25.
   1. Во-первых, deparaffinize слайды в oxylene, и увлажняют их в этанол градиентом до дистиллированной воды. После этого препараты окрашивали через железный гематоксилин решения Weigert в, 0,05% Быстрый зеленый (FCF) раствор, 1% раствором уксусной кислоты Solution, и 0,1% сафранином O Solution. Установите слайды с помощью смолистый среду.
   2. Оценка на Сафранин вывода окрашенных слайды на основе потери протеогликана (красный цвет) в хряще и процент разрушения в структуре хряща, сделать статистический анализ для гистологического счет.

Результаты

DMM модель была успешно создана в мышей, и дефицит PGRN преувеличены, вызванной хирургически, развитие ОА.

Шам и DMM операции (рис. 1) были выполнены в WT и PGRN-/ - мышей. 8 недель после операции, мышей умерщвляли и окрашивание сафранин О проводили на секциях из кол?...

Обсуждение

Он сообщил, что штамм мышей очень важно для DMM модели индукции, так как различные штаммы мышей различной степени тяжести ОА после DMM, с самого высокого уровня в штамме 129/SvEv, а затем C57BL6, 129/SvInJ а затем FVB / н ^26. Большая часть трансгенов установлены в C57BL6 мышей, таких как PGRN-/ - мышей, котор?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
No. 10 Surgical blades	Feather	25-2976#10
6-0 suture	Applied Dental	WG-N53133