הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Summary

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Abstract

מולקולות odorant נקשרות לקולטנים היעד שלהם באופן מדויק ומתואם. כל קולטן מזהה אות מסוימת ומעביר מידע זה למוח. ככזה, קביעת אופן בו מידע הרחה מועבר למוח, שינוי הן תפיסה והתנהגות, חקירה ראויה. מעניין לציין, כי יש ראיות המתעוררות כי גורמי התמרה ותעתיק תאיים מעורבים בפיזור של עצב קולטני ריח. כאן אנו מספקים כולה חזקים הר שיטת תיוג חיסוני לassay in vivo ארגון תא עצב קולטני ריח. באמצעות שיטה זו, זיהינו את כל תאי העצב קולטני הריח עם נוגדן אנטי ELAV, סמן פאן עצבי ידוע וOr49a-mCD8 :: ה-GFP, נוירון קולטני ריח במיוחד לידי ביטוי בנוירון-NBA באמצעות נוגדן אנטי-GFP.

Introduction

מערכת חוש הריח משמשת להבחין בין מגוון עצום של מולקולות ריח ולאחר מכן לשלוח את המידע וכתוצאה מכך למרכזי המוח גבוהים יותר. קלט זה משמש לשלוט במדויק התנהגות בעלי חיים בסיסית, כגון האכלה והזדווגות ^1-6. כמו כל סוג תא עצב חוש הריח קשור לקבוצה מסוימת של ריחות, הפיזור של תאי עצב קולטני ריח (orn) ים הוא חיוני לתפקוד התקין של מערכת חוש הריח נכון ^7.

הגנטיקה דרוזופילה מאפשרת לנו לבצע חקירה ברמת התא בודדת מעורבת מנגנונים מולקולריים הקשורים בהתפתחות orn ותפקוד פיסיולוגי ^8-16. immunostaining ההר השלם של אנטנות דרוזופילה אפשר לנו להבין בפירוט רב יותר את המנגנונים המולקולריים המעורבים בפיזור של תאי עצב קולטני ריח (orn) של ^7. במסמך זה אנו מספקים תיאור מקיף של שיטה פשוטה לachieve זה.

Protocol

1. הכן צלחת תפוחים

1. מערבבים 12.5 אגר גרם, 125 מיליליטר 100% מיץ זמין מסחרי תפוח, 12.5 גרם גלוקוז, ו375 מיליליטר H ₂ O. מיקרוגל את התערובת במשך 1 עד 2 דקות ויוצקים לצלחת תרבית תאי 3 סנטימטר. חנות ב 4 ° C.

2. צלב גנטי

1. השתמש בצלב הגנטי הנציג הבא:

Or49a-mCD8 :: ה-GFP / ארגון נוער קתולי x w ¹¹¹⁸

3. פרוטוקול Dissection והמכתים

1. להרדים את הזבוב ולאחר מכן לחתוך את הראש לטוס בצורה אנכית על ידי החזקתו באמצעות מלקחיים.
2. בזהירות להניח את חלק האנטנות המכילות בצלחת תפוחים.
3. חותכים את הקטע השלישי של האנטנה באמצעות מספריים לנתיחה בסדר.
4. הנח 90 μl של פתרון הקיבעון (paraformaldehyde 4% בPBST 0.1% (PBS עם 0.1% טריטון X-100)) לאמצע צלחת תרבות תחתית כוס.
5. בעדינות להעביר את antenn גזורAE עם מחט חדה ישירות לפתרון הקיבעון. במידת צורך, מבחינה פיזית להטביע את האנטנות לפתרון באמצעות מחט.
6. דגירה של 40 דקות בטמפרטורת חדר (RT). שטוף את האנטנות בPBST 0.4% (PBS עם 0.4% טריטון X-100), 3x 10 דקות בכל אחד, לשמור אותם באותה הצלחת. השתמש בעצות צהובות כדי להסיר ולהוסיף פתרון PBST. השתמש 90 μl של הפתרון לשטוף בכל פעם.
   הערה: אין להניח את הצלחת לתוך שייקר במהלך אימונוהיסטוכימיה. לפני הסרה או הוספת הפתרון לתוך הצלחת, להביא את כל האנטנות במרכז הצלחת באמצעות המחט וזהירות להוסיף או להסיר את הפתרון מהקצה של המנה.
7. חסום את האנטנות עם 90 μl של 5% בסרום סוס רגיל בPBST 0.1% 20 דקות ב RT.
8. לאחר הסרת חסימת הפתרון, דגירה האנטנות עם 90μl של נוגדנים עיקריים בPBST 0.1% המכילים 5% בסרום סוס ל48 שעות על 4 מעלות צלזיוס במכל לח כפי שתואר לעיל 8.
9. שטוף את אנטנות 6x 10 דקות בPBST 0.4%.
10. דגירה האנטנות עם 90 μl של נוגדנים משני בPBST 0.1% המכיל 5% בסרום סוס ל48 שעות ב 4 ° C. שטוף 6x 10 דקות באמצעות PBST 0.4%.
11. כדי לעלות את האנטנות, להסיר PBST ממנת התרבות ככל האפשר ולהציג בהדרגה שני ריכוזים שונים של גליצרול לאנטנות. ראשית להוסיף גליצרול 40% למנה ל1 עד 2 דקות; לאחר מכן להסיר את זה ולהוסיף גליצרול 80%.
12. לחלץ בזהירות את האנטנות (כולל גליצרול 80%) ממנת התרבות באמצעות קצה צהוב ומניח אותם על גבי שקופיות. מניח בעדינות coverslip על גבי וסוגר את קצות coverslip עם לק. האנטנות מוכנות להיות צילם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עכשיו.

תוצאות

הבטחה כי גם הנתיחה והקיבוע מבוצעים במהירות היא גורם מפתח בהשגת הצלחה בפרוטוקול זה. בעזרת מספריים ומלקחיים עדינים הוא גם חיוני. לאחר immunostaining, אנטנות ניאון שכותרתו נבדקו תחת מיקרוסקופ confocal. בדרך כלל אנחנו לוקחים את חלקי 1μm באמצעות עדשת 20x. אנו כותרת-NBA ⁷ ORNs באמצעות ...

Discussion

דיסקציה של אנטנת דרוזופילה אנו מתארים היא פשוט וקל לביצוע בסביבת מעבדה. כדי להבטיח לנתיחה מוצלחת, חיוני לנצל מספריים עדינים עם קצוות. בעוד immunostaining האנטנה גזור, חשוב כדי לדגור אותם במכל המלא בלחות, כדי למנוע אידוי של פתרון הנוגדן. יש האנטנה גזור נטייה לצוף בפתרון. ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stemi DV4 dissection microscope	Zeiss	Stemi DV4
Glass bottom culture dishes	MatTek corporation	P35G-0-10-C
Dissection scissor	Fine Science Tools	15000-08
Rat anti-ELAV	Developmental Studies Hybridoma Bank	7E8A10	Dilution 1:200
Mouse anti-GFP	Invitrogen	A11122	Dilution 1:400
Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-225-152	Dilution 1:200
Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	712-165-150	Dilution 1:200