에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

요약

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

초록

악취 물질 분자는 정확하고 조정 된 방법으로 자신의 목표 수용체에 결합한다. 각 수용체는 특정 신호를 인식하고 뇌에 정보를 중계한다. 이와 같이, 후각 정보 인식과 행동, 장점 조사를 모두 수정, 뇌에 전달하는 방법을 결정하는 단계를 포함한다. 흥미롭게도, 세포 전달 및 전사 인자는 후각 수용체 신경 세포의 다양 화에 관여하는 것을 새로운 증거가있다. 여기에서 우리는 강력한 전체가 생체 내 후각 수용체 신경 세포 조직을 분석 실험하는 면역 표시 방법을 마운트 제공합니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 안티 ELAV 항체 알려져 팬 신경 마커 Or49a-mCD8 :: GFP, 특히 안티 GFP 항체를 사용하여 NBA의 신경 세포에서 발현 후각 수용체 신경 세포의 모든 후각 수용체 뉴런을 확인했다.

서문

후각 시스템은 악취 분자의 거대한 다양한 구분할이어서 높은 뇌 센터에 생성 된 정보를 전송하기 위해 사용된다. 이 입력은 정확히 같은 먹이와 짝짓기 ^1-6로 기본적인 동물의 동작을 제어하는 데 사용됩니다. 각각의 후각 신경 세포의 종류가 냄새의 특정 세트, 후각 수용체 뉴런의 다양 화와 연관 될 때 (ORN)의 적절한 후각 시스템 기능 ⁷ 필수적이다.

초파리 유전학 ORN 개발 및 생리 기능 ^8-16과 관련된 분자 메커니즘을 포함하는 단일 세포 수준의 연구를 수행하는 가능하게한다. 초파리 안테나의 전체 마운트 면역 염색은 더 자세히 후각 수용체 뉴런의 다양 화에 관련된 분자 메커니즘 (ORN)의 ^7을 이해할 수있게되었습니다. 여기에서 우리는 교류에 간단한 방법의 포괄적 인 설명을 제공이 hieve.

프로토콜

1. 사과 접시를 준비합니다

1. 12.5 g 한천을 혼합, 125 ㎖의 100 % 시판 사과 주스, 12.5 g 포도당, 375 ML의 H ₂ O 1-2분의 혼합물을 전자 레인지와 3cm 세포 배양 접시에 붓는다. 4 ℃에서 보관

2. 유전 크로스

1. 다음과 같은 대표적인 유전 십자가를 사용

Or49a-mCD8 :: GFP / CYO X ^1,118 (W)

3. 해부 및 염색 프로토콜

1. 파리를 마취 한 다음 집게를 사용하여 개최하여 수직으로 비행 머리를 잘라.
2. 조심스럽게 사과 접시에 안테나를 포함하는 부분을 놓습니다.
3. 미세 해부 가위를 사용하여 안테나의 세 번째 세그먼트를 잘라.
4. 유리 바닥 배양 접시의 중간에 () 0.1 % 트리톤 X-100 0.1 % PBST (PBS에 4 % 파라 포름 알데히드)의 고정 솔루션의 9​​0 μl를 놓습니다.
5. 조심스럽게 해부 antenn 전송직접 고정 솔루션에 날카로운 바늘 AE. 필요한 경우, 물리적으로 바늘을 사용하여 용액에 안테나를 물속.
6. 실온 (RT)에서 40 분 알을 품다. 같은 접시에 그들을 유지 (0.4 % 트리톤 X-100과 PBS) 0.4 % PBST에 각각 3 배 10 분 안테나를 씻으십시오. PBST 솔루션을 제거하고 추가하는 노란색 팁을 사용합니다. 때마다 세척 용액 90 μl를 사용합니다.
   참고 : 면역 조직 화학 염색 동안 진탕에 접시를 올려 놓지 마십시오. 접시에 솔루션을 제거하거나 추가하기 전에 바늘을 사용하여 요리의 중심으로 모든 안테나를 가지고 조심스럽게 접시의 가장자리에서 솔루션을 추가하거나 제거 할 수 있습니다.
7. 실온에서 20 분 동안 0.1 % PBST 5 % 정상 말 혈청 90 μL와 안테나를 차단합니다.
8. 차단 솔루션을 제거한 후, 전술 한 바와 같이 축축한 용기에 4 ° C에서 48 시간 동안 5 % 말 혈청을 포함하는 0.1 % PBST에 차 항체의 90μl와 안테나를 품다 8.
9. 0.4 % PBST -10 분 6 배 안테나를 씻으십시오.
10. 4 ℃에서 48 시간 동안 5 % 말 혈청을 포함하는 0.1 % PBST 이차 항체의 90 μL와 안테나를 품어 0.4 % PBST를 사용하여 6 배 10 분 씻으십시오.
11. , 안테나를 탑재 가능한 한 배양 접시에서 PBST를 제거하고 점차적으로 안테나에 글리세롤의 두 개의 서로 다른 농도를 소개합니다. 처음 1 2 분 동안 요리에 40 % 글리세롤을 추가; 다음이를 제거하고 80 % 글리세롤을 추가합니다.
12. 조심스럽게 노란색 팁을 사용하여 배양 접시에서 (80 % 글리세롤을 포함한다) 안테나를 추출하고 슬라이드에 배치합니다. 조심스럽게 상단에 커버 슬립을 배치하고 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉. 안테나는 지금 형광 현미경으로 몇 군데 준비가​​ 된 것입니다.

결과

해부 및 고정 모두가 신속하게 수행하는 것을 보장하는 것은이 프로토콜을 사용하여 성공을 달성하는 핵심 요소입니다. 미세 가위와 집게를 사용하면 매우 중요합니다. 면역 염색 한 후, 형광 표지 된 안테나는 공 초점 현미경으로 관찰 하였다. 우리는 일반적으로 20 배 렌즈를 사용하여 1 ㎛ 섹션을. 우리는 NBA에게 Or49a-mCD8 :: GFP를 사용하여 ⁷ ORNs을 표시하고 야생 형 안테나의 NBA ORNs의 수?...

토론

우리가 설명하는 초파리 안테나의 해부는 단순하고 실험실 환경에서 수행하기 쉽습니다. 성공적인 절개를 보장하기 위해, 그것을 잘 양날 가위를 사용하는 것이 필수적입니다. 해부 안테나를 면역 염색 동안, 항체 용액의 증발을 방지하기 위해 습기가 채워진 용기들을 배양하는 것이 중요하다. 해부 안테나 솔루션에 떠있는 경향이있다. 고정 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤을 사용하고 단계를 차...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stemi DV4 dissection microscope	Zeiss	Stemi DV4
Glass bottom culture dishes	MatTek corporation	P35G-0-10-C
Dissection scissor	Fine Science Tools	15000-08
Rat anti-ELAV	Developmental Studies Hybridoma Bank	7E8A10	Dilution 1:200
Mouse anti-GFP	Invitrogen	A11122	Dilution 1:400
Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-225-152	Dilution 1:200
Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	712-165-150	Dilution 1:200