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Neste Artigo

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  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Resumo

Moléculas odoríferas ligam aos seus receptores-alvo de forma precisa e coordenada. Cada receptor reconhece um determinado sinal e retransmite essa informação para o cérebro. Como tal, a determinação de como a informação é transferida para olfactiva do cérebro, modificando tanto a percepção e comportamento, a investigação mérito. Curiosamente, não há evidências emergentes que transdução celular e transcrição fatores estão envolvidos na diversificação de neurônio receptor olfativo. Aqui nós fornecemos um todo robusto montar método de marcação imunológica do ensaio in vivo olfativo organização neurônio receptor. Usando este método, identificamos todos os neurônios receptores olfativos com o anticorpo anti-elav, um marcador pan-neural conhecido e Or49a-mCD8 :: GFP, um neurônio receptor olfativo especificamente expressos em Nba neurônio usando anticorpo anti-GFP.

Introdução

O sistema olfactivo é usado para distinguir entre uma imensa variedade de moléculas de odor e, subsequentemente, para enviar a informação resultante para os centros do cérebro superior. Esta entrada é usada para controlar com precisão os comportamentos animais fundamentais, como alimentação e acasalamento 1-6. Como cada tipo de neurônio olfativo está associada a um conjunto específico de odores, a diversificação de neurônios receptores olfativos (ORN) s é essencial para o bom funcionamento do sistema olfativo 7.

Genética de Drosophila nos permite realizar investigação único nível celular que envolve mecanismos moleculares associados ao desenvolvimento de ORN e função fisiológica 8-16. Whole immunostaining montagem de Drosophila antenas nos permitiu compreender em maior detalhe os mecanismos moleculares envolvidos na diversificação de neurônios receptores olfativos (ORN) s 7. Aqui nós fornecemos uma descrição completa de um método simples para achieve este.

Protocolo

1. Prepare placa maçã

  1. Misture 12,5 g de agar, 125 ml de sumo de 100% disponível comercialmente de maçã, 12,5 g de glucose, e 375 ml de H 2 O. Microondas a mistura durante 1 a 2 minutos e derramar para o prato de cultura de 3 centímetros de células. Armazenar a 4 ° C.

2. Cruzamento genético

  1. Use o seguinte cruzamento genético representativo:

Or49a-mCD8 :: GFP / cyo x w 1118

3. Dissecção e coloração protocolo

  1. Anestesiar a voar e, em seguida, cortar a cabeça voar verticalmente, segurando-o com uma pinça.
  2. Com cuidado, coloque a parte que contém antenas em uma placa de maçã.
  3. Corte o terceiro segmento da antena com uma tesoura de dissecção finas.
  4. Colocar 90 mL de solução de fixação (4% de paraformaldeído em 0,1% de PBST (PBS com 0,1% de Triton X-100)) para o meio de um prato de cultura de fundo de vidro.
  5. Gentilmente transferir o antenn dissecadoae com uma agulha fina diretamente para a solução de fixação. Se necessário, submergir fisicamente as antenas na solução usando agulha.
  6. Incubar durante 40 minutos à temperatura ambiente (RT). Lava-se a antenas de 0,4% de PBST (PBS com 0,4% de Triton X-100), 3 x 10 minutos em cada um, mantê-los no mesmo prato. Utilize pontas amarelas para remover e adicionar solução PBST. Utilizar 90 mL de solução de lavagem de cada vez.
    NOTA: Não coloque o prato em um shaker durante imunohistoquímica. Antes de retirar ou acrescentar a solução para o prato, trazer todas as antenas para o centro do prato utilizando a agulha e cuidadosamente adicionar ou retirar a solução a partir da borda do prato.
  7. Bloquear as antenas com 90 ul de 5% de soro normal de cavalo a 0,1% em PBST, durante 20 minutos à RT.
  8. Após a remoção da solução de bloqueamento, incubar as antenas com 90μl de anticorpos primários em PBST contendo 0,1% a 5% de soro de cavalo durante 48 horas a 4 ° C em um recipiente tal como descrito previamente humedecida 8.
  9. Lava-se a antenas de 6x 10 minutos em 0,4% de PBST.
  10. Incubar a antenas com 90 ul de anticorpos secundários em PBST contendo 0,1% a 5% de soro de cavalo durante 48 horas a 4 ° C. Lavar 6x 10 minutos usando 0,4% de PBST.
  11. Para montar as antenas, remover PBST a partir do prato de cultura, tanto quanto possível, e, gradualmente, apresentar duas concentrações diferentes de glicerol às antenas. Primeiro adicionar 40% de glicerol para o prato durante 1 a 2 minutos; em seguida, retire este e adicionar 80% de glicerol.
  12. Extrair cuidadosamente as antenas (incluindo 80% de glicerol) da placa de cultura com ponta amarela e colocá-las em um slide. Delicadamente, coloque uma lamela em cima e selar as bordas lamela com unha polonês. As antenas estão agora prontos a ser trabalhada por meio de microscopia de fluorescência.

Resultados

A garantia de que tanto a dissecção e fixação são realizadas rapidamente é um fator chave para alcançar o sucesso com este protocolo. Usando uma tesoura fina e pinças também é crucial. Após imunocoloração, fluorescentes rotulado antenas foram examinados sob um microscópio confocal. Nós, normalmente, seções 1 Hm usando uma lente de 20x. Nós rotulado Nba 7 ORNs usando Or49a-mCD8 :: GFP e contou o número de Nba ORNs no tipo selvagem antena. O repórter mCD8-GFP está localizada membrana celula...

Discussão

A dissecção da antena Drosophila descrevemos é simples e fácil de executar em um ambiente de laboratório. Para garantir uma dissecção bem sucedido, é essencial utilizar uma tesoura fina gumes. Enquanto a antena imunocoloração dissecado, que é importante para incubar em um recipiente cheio de humidade para evitar a evaporação da solução de anticorpo. A antena dissecados tem uma tendência para flutuar na solução. Utilizando 0,1% de Triton em PBS, durante a fixação e bloqueio passos irá facili...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Programa MEXT-suportada para a Fundação de Pesquisa Estratégica em Universidades Privadas e JSPS Jovem Cientista B subvenção para HT Gostaríamos de agradecer Ohtake Norihito para editar os vídeos.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Stemi DV4 dissection microscopeZeissStemi DV4
Glass bottom culture dishes MatTek corporationP35G-0-10-C
Dissection scissorFine Science Tools15000-08
Rat anti-ELAVDevelopmental Studies Hybridoma Bank7E8A10Dilution 1:200
Mouse anti-GFPInvitrogenA11122Dilution 1:400
Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-225-152Dilution 1:200
Donkey Anti-Rat IgGJackson ImmunoResearch Laboratories712-165-150Dilution 1:200

Referências

  1. Christensen, T. A., White, J. . Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , 201-232 (2000).
  2. Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
  3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
  4. Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
  5. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
  6. Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
  7. Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
  8. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. , (2011).
  9. Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
  10. Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
  11. Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
  12. Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
  13. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
  14. Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
  15. Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
  16. Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).

Reimpressões e Permissões

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