Tout le mont immunomarquage des récepteurs olfactifs neurones dans le<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenne

Résumé

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Résumé

Molécules odorantes se lient à leurs récepteurs cibles d'une manière précise et coordonnée. Chaque récepteur reconnaît un signal spécifique et transmet cette information au cerveau. En tant que tel, de déterminer comment l'information olfactive est transféré vers le cerveau, modifiant à la fois la perception et le comportement, l'enquête de fond. Fait intéressant, il est évident que des facteurs de transduction cellulaire et la transcription sont impliqués dans la diversification de neurone récepteur olfactif. Ici, nous fournissons un support de l'ensemble robuste méthode de marquage immunologique pour doser olfactif organisation in vivo des neurones récepteurs. En utilisant cette méthode, nous avons identifié tous les neurones récepteurs olfactifs avec l'anticorps anti-ELAV, un marqueur pan-neuronal connu et Or49a-mCD8 :: GFP, un neurone récepteur olfactif spécifiquement exprimée dans Nba neurone en utilisant un anticorps anti-GFP.

Introduction

Le système olfactif est utilisé pour faire la distinction entre une immense variété de molécules odorantes et ensuite envoyer les informations résultant des centres supérieurs du cerveau. Cette entrée est utilisée pour contrôler avec précision les comportements animaux fondamentales, telles que l'alimentation et l'accouplement ^1-6. Comme chaque type de neurone olfactif est associée à un ensemble spécifique d'odeurs, la diversification des neurones récepteurs olfactifs (ORN) s est essentiel pour le fonctionnement du système olfactif bon ^7.

Génétique de la Drosophile nous permet d'effectuer des investigations au niveau de la cellule unique impliquant des mécanismes moléculaires associés au développement de ORN et la fonction physiologique ^8-16. Tout le immunomarquage montage de la drosophile antennes nous a permis de comprendre plus en détail les mécanismes moléculaires impliqués dans la diversification des neurones récepteurs olfactifs (ORN) s ^7. Ici, nous fournissons une description détaillée d'une méthode simple pour acHieve cela.

Protocole

1. Préparer la plaque de pomme

1. Mélanger 12,5 g de gélose, 125 ml 100% disponible dans le commerce du jus de pomme, 12,5 g de glucose et 375 ml _de H ₂ O. Micro-ondes le mélange pendant 1 à 2 minutes et verser dans le plat de la culture 3 cm de cellule. Stocker à 4 ° C.

2. Transversale Genetic

1. Utilisez le croisement génétique représentant suivant:

Or49a-mCD8 :: GFP / CYO x w ¹¹¹⁸

3. Dissection et coloration protocole

1. Anesthésier la volée, puis couper la tête à la mouche à la verticale en le tenant à l'aide d'une pince.
2. Placez délicatement la partie antennes contenant sur une plaque de pomme.
3. Couper le troisième segment de l'antenne à l'aide des ciseaux fins de dissection.
4. Placer 90 ul de la solution de fixation (4% de paraformaldehyde dans 0,1% de PBST (PBS avec 0,1% de Triton X-100)) au milieu d'une boîte de culture à fond en verre.
5. Transférer délicatement le Antenn disséquéae avec une aiguille directement dans la solution de fixation. Si nécessaire, plonger physiquement les antennes dans la solution en utilisant l'aiguille.
6. Incuber pendant 40 minutes à la température ambiante (RT). Laver les antennes à 0,4% du PBST (PBS avec 0,4% de Triton X-100), 3 x 10 minutes dans chaque, en les maintenant dans le même plat. Utilisez pointes jaunes à enlever et ajouter la solution PBST. Utiliser 90 pl de la solution de lavage à chaque fois.
   REMARQUE: Ne pas placer le plat dans un shaker pendant immunohistochimie. Avant de retirer ou d'ajouter la solution dans le récipient métallique, faire toutes les antennes dans le centre de la boîte à l'aide de l'aiguille et avec précaution d'ajouter ou de supprimer la solution à partir du bord de la cuvette.
7. Bloquer les antennes avec 90 ul de 5% de sérum de cheval normal dans du PBST à 0,1% pendant 20 minutes à température ambiante.
8. Après avoir retiré la solution de blocage, incuber les antennes avec 90 pi d'anticorps primaires dans du PBST à 0,1% contenant 5% de sérum de cheval pendant 48 h à 4 ° C dans un récipient tel que décrit précédemment humidifié 8.
9. Laver les antennes 6x 10 minutes dans 0,4% PBST.
10. Incuber les antennes avec 90 ul d'anticorps secondaire dans du PBST à 0,1% contenant 5% de sérum de cheval pendant 48 heures à 4 ° C. Laver 6x 10 minutes en utilisant 0,4% PBST.
11. Pour monter les antennes, retirez PBST de la boîte de culture autant que possible et d'introduire progressivement deux concentrations différentes de glycérol à l'antenne. Ajouter d'abord 40% de glycerol à l'antenne pendant 1 à 2 minutes; puis supprimer ce et ajouter 80% de glycérol.
12. Retirez délicatement les antennes (dont 80% de glycérol) de la boîte de culture en utilisant la pointe jaune et placez-les sur une lame. Placez délicatement une lamelle sur le dessus et sceller les bords de lamelle avec du vernis à ongles. Les antennes sont maintenant prêtes à être imagée par microscopie à fluorescence.

Résultats

Veiller à ce que les deux la dissection et la fixation sont effectuées rapidement est un facteur clé dans la réussite de ce protocole. Avec des ciseaux et des pinces fines est également cruciale. Après immunomarquage, marqués par fluorescence antennes ont été examinées sous un microscope confocal. Nous prenons normalement sections de 1 um en utilisant une lentille 20x. Nous avons étiqueté Nba ⁷ ORNs utilisant la GFP de Or49a-mCD8 et compté le nombre de Nba ORNs antenne de type sauvage. Le reporte...

Discussion

La dissection de l'antenne Drosophila nous décrivons est simple et facile à réaliser dans un environnement de laboratoire. Pour assurer une dissection de succès, il est essentiel d'utiliser des ciseaux bien tranchants. Alors que la coloration immunologique antenne disséqué, il est important de les incuber dans un récipient rempli d'humidité pour éviter l'évaporation de la solution d'anticorps. L'antenne disséqué a tendance à flotter dans la solution. Utilisation de 0,1% de T...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stemi DV4 dissection microscope	Zeiss	Stemi DV4
Glass bottom culture dishes	MatTek corporation	P35G-0-10-C
Dissection scissor	Fine Science Tools	15000-08
Rat anti-ELAV	Developmental Studies Hybridoma Bank	7E8A10	Dilution 1:200
Mouse anti-GFP	Invitrogen	A11122	Dilution 1:400
Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-225-152	Dilution 1:200
Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	712-165-150	Dilution 1:200