Всего Гора иммунного обонятельных рецепторов нейронов в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Антенны

Резюме

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Аннотация

Пахучих молекул связываются с их целевыми рецепторами в точном и скоординированным образом. Каждый рецептор распознает специфический сигнал и передает эту информацию в мозг. Таким образом, определение того, как обонятельная информация передается в мозг, изменяя как восприятие и поведение, заслуживает изучения. Интересно, что появляется все больше доказательств, что сотовой трансдукции и транскрипционные факторы участвуют в диверсификации обонятельной нейрона рецептора. Здесь мы предлагаем надежные вся гора иммунологический способ маркировки для анализа в естественных условиях обонятельный организацию рецепторов нейронов. Используя этот метод, мы определили все обонятельные нейроны рецептора с анти-Elav антитела, известный пан-нейронной маркера и Or49a-mCD8 :: GFP, обонятельного рецептора нейрона специально выражается в НБА нейрона с использованием анти-GFP антитела.

Введение

Обонятельная система используется, чтобы различать между огромным разнообразием молекулами запаха и впоследствии отправить получаемую информацию на высших мозговых центров. Этот вход используется для точного контроля фундаментальные поведения животных, такие как кормление и спаривание ^1-6. Поскольку каждый обонятельный Тип нейрон связан с определенным набором запахов, диверсификации обонятельных рецепторных нейронов (ORN) с является жизненно необходимым для обонятельной системы функции ^7.

Drosophila генетика позволяет нам выполнять один расследование клеточном уровне с участием молекулярных механизмов, связанных с развитием ORN и физиологической функции ^8-16. Вся гора иммуноокрашивание Drosophila антенн позволило нам понять более подробно молекулярные механизмы, участвующие в диверсификации обонятельных рецепторных нейронов (ORN) с ^7. При этом мы предоставляем всестороннее описание простой метод для переменного токаhieve это.

протокол

1. Подготовка яблочный пластину

1. Смешайте 12,5 г агара, 125 мл 100% коммерчески доступного яблочный сок, 12,5 г глюкозы и 375 мл H ₂ O. Микроволновая смеси в течение от 1 до 2 минут и вылить на блюдо 3 см клеточной культуре. Хранить при температуре 4 ° C.

2. Генетическая крест

1. Используйте следующую представительство генетический крест:

Or49a-mCD8 :: GFP / суо х Ш ¹¹¹⁸

3. Протокол Вскрытие и окрашивание

1. Обезболить муху, а затем вырезать летать голову вертикально, удерживая его с помощью пинцета.
2. Аккуратно положите антенн, содержащий часть на яблоко пластины.
3. Разрежьте третий сегмент антенны с использованием тонких ножниц рассечение.
4. Поместите 90 мкл фиксирующего раствора (4% параформальдегида в 0,1% PBST (PBS с 0,1% Triton X-100)) в середине со стеклянным дном чашки для культивирования.
5. Аккуратно передачи расчлененный Antennае с острой иглой непосредственно в фиксирующем растворе. При необходимости физически погрузить антенны в растворе с использованием иглы.
6. Инкубировать в течение 40 минут при комнатной температуре (RT). Вымойте антенны в 0,4% PBST (PBS с 0,4% Triton X-100), 3x 10 минут в каждом, держа их в том же блюде. Используйте желтые советов, удалять и добавлять решение PBST. Используйте 90 мкл промывочного раствора каждый раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не устанавливайте блюдо в шейкер во иммуногистохимии. Перед удалением или добавлением раствора в блюдо, принести все антенны в центр блюда, используя иглу и осторожно добавить или удалить решение от края тарелки.
7. Блок антенн с 90 мкл 5% нормальной лошадиной сыворотки в 0,1% PBST в течение 20 минут при комнатной температуре.
8. После удаления блокирующего раствора, инкубировать антенн с 90 мкл первичных антител в 0,1% PBST, содержащем 5% лошадиной сыворотки в течение 48 ч при 4 ° С в увлажненной контейнера, как описано ранее 8.
9. Вымойте антенны 6x 10 минут в 0,4% PBST.
10. Инкубируйте антенны с 90 мкл вторичных антител в 0,1% PBST, содержащем 5% лошадиной сыворотки в течение 48 ч при 4 ° С. Вымойте 6х 10 минут с помощью 0,4% PBST.
11. Для установки антенны, удалить PBST из культуральной чашке, насколько это возможно, и постепенно вводить двух разных концентраций глицерина к антеннам. Сначала добавьте 40% глицерина в чашке в течение от 1 до 2 минут; затем снимите это и добавить 80% глицерина.
12. Осторожно извлечь усики (в том числе 80% глицерина) из культуральной блюдо, используя желтый наконечник и разместить их на слайд. Аккуратно поместите покровное на вершине и печать покровное края с лаком для ногтей. Усики готов для включения в образ с помощью флуоресцентной микроскопии.

Результаты

Обеспечение соответствия рассечение и фиксация выполняются быстро является ключевым фактором в достижении успеха с этим протоколом. Использование тонких ножниц и щипцов также имеет решающее значение. После иммуноокрашивания, люминесцентные помечены антенны исследовали под конфока...

Обсуждение

Рассечение антенны Drosophila мы описываем является простым и легким для выполнения в лабораторных условиях. Чтобы обеспечить успешное вскрытие, важно использовать тонкой краями ножниц. В то время как иммунного окрашивания рассеченные антенну, важно, чтобы инкубировать их в влаги зап...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stemi DV4 dissection microscope	Zeiss	Stemi DV4
Glass bottom culture dishes	MatTek corporation	P35G-0-10-C
Dissection scissor	Fine Science Tools	15000-08
Rat anti-ELAV	Developmental Studies Hybridoma Bank	7E8A10	Dilution 1:200
Mouse anti-GFP	Invitrogen	A11122	Dilution 1:400
Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-225-152	Dilution 1:200
Donkey Anti-Rat IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	712-165-150	Dilution 1:200