ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Summary

כאן אנו מתארים זרימת עבודה עבור מהירות ניתוח ולחקור את האוספים של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות PhenoRipper, פלטפורמת דימוי ניתוח שפותחה לאחרונה.

Abstract

למרות התקדמות מהירה במיקרוסקופיה תפוקה גבוהה, מבחני מבוססי תמונת כמותית עדיין להוות אתגר משמעותי. בעוד מגוון רחב של כלים לניתוח תמונה מיוחדים זמין, רוב זרימות עבודה המבוססת על דימוי ניתוח מסורתי עקומות תלולות למידה (לכוונון עדין של פרמטרים ניתוח) ולגרום לזמני אספקה ​​ארוכים בין ההדמיה וניתוח. בפרט, פילוח תא, התהליך של זיהוי תאים בודדים בתמונה, הוא צוואר בקבוק עיקרי בעניין זה.

כאן אנו מציגים חלופי,-ללא פילוח תא זרימת עבודה המבוססת על PhenoRipper, פלטפורמת תוכנה בקוד פתוח המיועדת לניתוח והבדיקה של תמונות מיקרוסקופיה מהירים. הצינור שהוצג כאן הוא מותאם לתמונות מיקרוסקופיה immunofluorescence של תרביות תאים ודורש התערבות משתמש מינימאלית. תוך חצי שעה, PhenoRipper יכול לנתח נתונים מניסוי 96 היטב טיפוסי וליצור פרופילי תמונה. משתמשים יכוליםאז מבחינה ויזואלית לחקור את הנתונים שלהם, לבצע בקרת איכות בניסוי שלהם, להבטיח תגובה להפרעות וסמנו את שחזור של משכפל. זה מקל על מחזור משוב מהיר בין הניתוח וניסוי, שהוא חיוני במהלך assay אופטימיזציה. פרוטוקול זה שימושי לא רק כניתוח ראשון לעבור לבקרת איכות, אלא גם יכול לשמש כפתרון קצה לקצה, במיוחד להקרנה. זרימת העבודה המתוארת כאן מאזניים לערכות נתונים גדולים כמו אלה שנוצרו על ידי מסכי תפוקה גבוהה, והוכחה תנאי ניסוי קבוצה על ידי פנוטיפ מדויק על פני טווח רחב של מערכות ביולוגיות. ממשק PhenoBrowser מספק מסגרת אינטואיטיבי כדי לחקור את חלל פנוטיפי ומתייחס מאפייני תמונה להסברים ביולוגיים. יחדיו, הפרוטוקול המתואר כאן יוריד את החסמים לאימוץ ניתוח כמותי של מסכי מבוססי תמונה.

Introduction

במהלך העשור האחרון, התקדמות מהירה בטכנולוגיית הדמיה נתנו מעבדות רבות את היכולת לבצע מיקרוסקופיה תפוקה גבוהה. האתגר כעת עבר מאחד לאחד של הדמיה של ניתוח. איך אנחנו יכולים לאפיין, להשוות, ולחקור את סיקור של פנוטיפים אך עדינים מורכבים שנוצרו על ידי מסך הדמיה תפוקה גבוהה טיפוסי?

מספר פלטפורמות דימוי ניתוח ואינפורמטיקה נתן ארגזי כלים מתוחכמים משתמשי ^1-3 לחילוץ מידע ביולוגי מאוספים גדולה של תמונות. עם זאת, רבי מכשולים משמעותיים להישאר בניתוח נתונים ממסכים מבוסס תמונת תפוקה גבוהה. קשיים כרוכים בבחירת אפיונים מתאימים של התמונות וכוונון עדין של פרמטרים אלגוריתמיים (למערכת של עניין) לעתים קרובות לגרום להתקנה פעמים רבות, במיוחד עבור משתמשים ללא מומחיות דימוי ניתוח. בפרט, פילוח תא, התהליך של זיהוי תאים בודדים בתמונת n, היא צוואר בקבוק עיקרי בעניין זה. פילוח יכול להיות רגיש מאוד לפרמטרים ניסיוניים כגון סוג תא, צפיפות תאים וביו סמנים, ולעתים קרובות דורש התאמה חוזרת ונשנית לערכת נתונים גדולה. מסיבות אלה, ניתוח תמונה הוא לעתים קרובות צעד עצמאי, מסוף שבוצע על ידי מומחים ולא חלק משולב של זרימת העבודה הניסיונית. זה מונע את מחזור המשוב המהיר בין הניתוח וניסוי, חלק חיוני של פיתוח assay.

כאן אנו מתארים זרימת עבודה חלופית כי הוא מותאם למיקרוסקופ פלואורסצנטי תפוקה גבוהה ומונעת הרבה מהקשיים האמורים לעיל. לשם כך, אנו עושים שימוש ⁴ PhenoRipper, פלטפורמת תוכנה בקוד פתוח לחיפוש וניתוח של תמונות מיקרוסקופ מהירים. באופן משמעותי, PhenoRipper נמנע רבים מהאתגרים כרוכים בפילוח תא על ידי לא מנסה לזהות תאים בודדים. במקום זאת, PhenoRipper מחלק תמונות לתוך פיקסלבלוקים של גודל subcellular ומאפיינים את הדמויות במונחים של בלוקים שהם מכילים. באופן ספציפי, PhenoRipper פרופילי לוקים במונחים של-מבוסס colocalization סמן תכונות ומזהה באופן אוטומטי ⁴ הסוגים לחסום הנציג ביותר בתמונות אימונים. PhenoRipper לאחר מכן מקצה לכל בלוק סוג בלוק נציג הדומה ביותר, ולבסוף מאפיין תמונות המבוססות על סוגים בלוקים שהם מכילים.

בהשוואה ליותר יחידה מבוסס תאי גישות מסורתיות, גישה זו דורשת כוונון עדין ומומחיות מינימאליים. ככזה, משתמשים רק צריכים להגדיר שני פרמטרים: גודל הבלוק ועוצמת סף (להשליך חלקי noncellular של תמונה), אשר שניהם נקבעים עם משוב גרפי. חשוב מכך, זרימת העבודה שתוארה כאן הוכח ⁴ בקנה מידה בקלות לערכות נתונים גדולים בהרבה, שבו המהירות והכוונון עדין מינימאלי מספקת זמן גדול ורווחי אמינות. בפועל, אנו מוצאים כי יישום זהמקק מפחית את הזמן הנדרש הן להתקנה ולהפעלתו על ידי צווים שונים של גודל ^4.

התפוקה העיקרית של PhenoRipper היא ייצוג חזותי של דמיון תמונה, המאפשרת למשתמש לזהות קבוצות של תנאי ניסוי שגורמים לתאים להציג פנוטיפים דומים. יש הקבוצות PhenoRipper מוצאת בדרך כלל "interpretability ביולוגי" דומה לאלה שנוצרו על ידי יותר, שיטות מבוססות תאי זמן רב ^4. בפועל, זה אומר כי לעתים קרובות, בתוך חצי שעה של ביצוע ניסוי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 96 היטב טיפוסי, הנסיין ללא ניסיון דימוי ניתוח לפני יכול לקבל קריאת נתונים אמינות לגבי הביצועים של הניסוי שלו או שלה. הנסיין אז יכול להתחיל לחקור את יחסי הגומלין בין תנאי ניסוי שונים ומתייחס ליחסים אלה פנוטיפים תמונה.

אנו מדגימים זרימת עבודה זו לכאן על ידי ניתוח ההשפעותשל תרופות בכיתות מכניסטית מובחנות בתאי הלה מוכתמים עבור סמני DNA וcytoskeletal. תמונות של תאים שטופלו באותה הכיתה של תרופות קובצו יחד, ותמונות באיכות ירודה (חפצים מכתים, מתוך תאי מיקוד וכן הלאה) הופיעו כחריגים, מה שהופך אותם קלים לזהות ואפשרות למחוק.

בעוד זרימת עבודה זו היא שימושית עבור מספר רב של מבחני המבוסס על תמונה, יש מצבים רבים שבם בבירור בגישה שונה עלולה להיות יותר אינפורמטיבי. לדוגמא, הפלט מPhenoRipper הוא בעיקר השוואה היחסית של דפוסי הקרינה על פני תנאי ניסוי. אם אפיון מוחלט של תכונת תא בודדת ספציפית נדרש במקום (לדוגמא מספר הכתמים בתא), יידרש-מבוסס תא בודד ניתוח. עם זאת, גם בסוג זה של מצב, PhenoRipper עשוי לזהות שינויים בפנוטיפים תא בודד האלה, ולכן להיות כלי שימושי עבור opti assaymization.

Protocol

1. דוגמאות והדמיה הכנה

1. תרבית תאים
   1. פיצול תרבויות באופן שיגרתי ולשמור במפגש 20-70%. יום אחד לפני הניסוי, לגדל תאי הלה בDMEM (הנשר בינוני השתנה Dulbecco, ראה טבלה של חומרים) ותוספת 10% FBS (בסרום שור עוברי) ו1x פניצילין / סטרפטומיצין.
   2. ביום של ניסוי, תאי פיצול גדל בתרבות (מחוברות כ -50%).
   3. שטוף תאים עם PBS (בופר פוספט), לחשוף לכ 2 מיליליטר של טריפסין / EDTA (חומצת ethylenediaminetetraacetic) לכמה שניות. לשאוב טריפסין עודף / EDTA ולשמור על תאים שטופים בשכבה דקה של טריפסין / EDTA בשכונה ב RT ל~ 3 דקות.
   4. מכאני לנער צלוחיות פעמיים ולנתק תאים עם תקשורת בסרום בתוספת. ספירת תאים ו לדלל את 5,000 cells/50 μl של תקשורת ומייד צלחת 50 μl / גם על צלחת זכוכית תחתונה 384 גם באמצעות רובוט נוזל טיפול אוטומטי (רק 30 היטבים של הצלחת משמשים כאן).
   5. דגירה צלחת על RT במשך 30 דקות כדי למזער את השפעות קצה בבארות ^5. לאחר צלחות הדגירה RT, מקום בC 5% CO חממה 37 ° / ₂ לילה.
   6. כל תרופה תהיה assayed בשני עותקים. הוסף 25 μl של תרופה לבארות המתאימות על הצלחת כבר מכילה מדיה.
   7. תקן את הצלחת עם 4% פתרון paraformaldehyde ב-PBS בטיפול תרופתי שלאחר שעות 24.
2. הכתמה
   הנוגדנים הספציפיים הראשוניים, נוגדנים משני שכותרתו fluorescently וכתמי ניאון אחרים ששמשו כאן מפורטים בטבלה של חומרים.
   1. Permeabilize קבוע תאים עם 0.2% טריטון ב TBS פתרון X-100 (שנאגר מלוח טריס) במשך 3 דקות, ולשטוף עם TBST (שנאגר מלוח טריס + Tween 20) 3x. הוסף 5% פתרון BSA (שור הסרום אלבומין) ב TBST לחסימה.
   2. דגירה צלחת ב RT במשך שעה 2 ולאחר מכן לשטוף עם 3x TBST.
   3. הפוך dilut נוגדן הראשונייוני BSA 5% ב TBST (ראו טבלה של חומרים) ולהוסיף 10 μl / טוב. דגירה צלחת ב RT במשך שעה 2, ולאחר מכן לשטוף 3x עם TBST.
   4. הפוך BSA dilutionin נוגדנים משני 5% ב TBST (ראה טבלה של חומרים) ולהוסיף 10 μl / טוב.
   5. דגירה צלחת בחושך ב RT עבור שעה 2 ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם TBST.
   6. הכן דילולים לHoechst וphalloidin (ראה טבלה של חומרים) בPBS ולהוסיף 10 μl / טוב.
   7. דגירה את הצלחת בחושך במשך 30 דקות ב RT.
   8. לאחר 2 washes TBST, פרוניט רדיד חנות 4 ° CO / נ
3. הדמיה
   לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence באמצעות מטרת 20X עם binning המצלמה 1x1. לרכוש תמונות שש עשרה לכל טוב, עבור סכום כולל של 480 תמונות (ערוצי x3).

2. ניתוח תמונות

הורד והתקן את PhenoRipper מphenoripper.org, ולהשיק PhenoRipper להתחיל ניתוח של הר"יGES. PhenoRipper תומך TIFF כיום, PNG, ו-JPEG וכל הפורמטים האחרים הנתמכים על ידי MATLAB (תוכנת מיקרוסקופ תומכים בדרך כלל ביצוא לTIFF).

2.1 טוען נתונים

1. אין ועידת שמות / ארגון סטנדרטי קיימת לתמונות מיקרוסקופית, אשר יכול להפוך את טעינת תמונות ומטה שיוך (כלומר הסברים ניסיוניים כגון סוג טיפול, גם מספר וכן הלאה) חלק המאתגר ביותר של זרימת העבודה. בחר באחת מהשיטות שהוצגו (שיפורט להלן).
   1. PhenoLoader: בחר באפשרות זו כדי למחצה באופן אוטומטי לטעון את הנתונים כאשר שם הקובץ ו / או מבנה ספרייה מכיל מספיק מידע לתמונות קבוצה כרצוי (למשל B16 HeLa_Drug5-DAPI.png מצביע על אפשרות שהתמונה היא מגם B16, טיפול בתאים עם הסמים זיהוי שלו הוא 5, ואת התמונה לוכדת את כתם DAPI הגרעיני - עם יום אמנה זו, את כל תמונות מהיטב A1 או שטופלו בתרופות 5 יכולה להיות מקובצים בקלות). האשףמוביל את משתמש השלב אחר שלב כדי לשייך מטה עם קבוצות תמונה ולהגדיר את הסמנים באופן הבא:
      1. לחץ "מבנה קובץ" לגשת חלון PhenoLoader.
      2. לחץ על "הגדרת מדריך שורש" כדי לבחור את הספרייה המכילה את בסיס נתוני תמונה. ואז לסנן לניתוח (לא חובה, ניתן להשאיר ריק) קבצים שאינם בשימוש (קבצים שאינם בשימוש).
      3. לחץ על "סמני הגדר" כדי לציין את הסמנים הביולוגיים המשמשים בניסוי ולקשר אותם עם התמונות. באופן ספציפי, לחץ על קובץ תמונה ולאחר מכן בחר בחלק משם הקובץ שמזהה באופן ייחודי את הסמנים הביולוגיים. לבסוף, הזן שם עבור כל סמן ביולוגי.
      4. לחץ על "מידע נוסף על הגדר" כדי לשייך את המידע עם כל תמונה. באופן ספציפי, לחץ על קובץ תמונה ולאחר מכן בחר בחלק משם קובץ זיהוי מידע על תמונה ("B16" למשל לשם טוב). חלון המבקש לשם קבוצה (לדוגמא "אנחנוll ") יצוץ, הזן שם. חברי הקבוצה חולץ מהקובץ יוצגו בטבלת הקבוצות (לדוגמא את הרשימה המלאה של שמות כן). כדי להוסיף פרטים נוספים שלא קיימים בקובץ, לחץ על" (לא חובה) הבא "כפתור. לחץ על" הוסף קבוצת מידע ", הזן את שם קבוצה נוסף (למשל," תרופות ") ולכל ערך של הקבוצה המוגדרת מראש (למשל" טוב "), הזן את הערך שלו (למשל" טקסול ") . אין הגבלה למספר קבוצות נוספות שניתן להוסיף.
      5. לבסוף, לחץ על "Metadatafile צור" כדי ליצור את הקובץ מטה ולהמשיך את הניתוח. אם קובץ metadata כבר נוצר בעבר, ניתן להימנע מהשלבים שלעיל ישירות על ידי טעינת הקובץ באמצעות האפשרות "קובץ מידע" (מתואר ב3 להלן).
   2. תבניות ביטוי רגיל בהתבסס: ביטויים רגולריים הם גישה סטנדרטית לדפוסי התאמהבטקסט. בחר באפשרות זו כאשר שם הקובץ ו / או מבנה ספרייה מכיל מספיק מידע לתמונות קבוצתיות ואמנת השמות מתאימה לאחד מהתבניות קיימים מראש. תבניות מותאמות אישית המבוססות על ביטויים רגולריים עשויות גם להיות מוגדרות באופן ידני ולשימוש חוזר. אפשרות מתקדמת זו מומלצת רק עבור משתמשים מכירים ביטויים רגולריים.
   3. בקבצי מידע נוסף: בחר באפשרות זו להתאמה אישית אולטימטיבית. להגדיר ולטעון ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) המכילים שמות קבצים ומטה הקשורים לכל תמונה. דוגמא לקובץ בפורמט נגיש בחלק להורדה של אתר האינטרנט (phenoripper.org). פשוט לטעון את הקובץ באמצעות הממשק כדי להציג את המידע שהוא מכיל.
2. בחר את השדה מטה שמגדיר משכפל בניסוי כדי למנוע דגימה מיותרת. עבור ערכות נתונים המכילות משכפל (למשל את כל התמונות ובצריכות להיות דומות), לקבץ אותן יחד (למשל על ידי היטב) יכול הופעותביצועים אובים. ברוב המקרים זה סביר לבחור את ברירת המחדל "אקראי (לא יודע)", שבוחרת תת קבוצה אקראית.

2.2 הגדרת פרמטרי ניתוח

לחץ על "פרמטרים שנקבע" כדי להגדיר את הפרמטרים הדרושים כדי לעבד את הנתונים. הפרמטרים להגדרה הם בפנל השמאלי. הפנל הימני מציג מדגם ממוזג של בסיס הנתונים. לחץ על החצים שמאלה / ימינה כדי לעבור בין תמונות שונות.

1. עצמת סף: בחר ערך סף מתאים לזהות בערך מנות הסלולריות (ולא רקע, אזורי noncellular) של תמונות. סף precalculated ידי PhenoRipper, אבל יכול להיות מותאם כדי לשפר את ההדגשה של אזורים הסלולריים באמצעות פס הגלילה נגיש בחלק העליון של התמונה. אם סף בחר לא עובד בכל התמונות, להוריד את הסף כך שיכלול אזורי noncellular ולא יורדים אזורים סלולריים.
2. הבלוק Size: בחר בגודל מתאים לחסום (בפיקסלים) לרשת את התמונה. בלוקים של גודל שצוין יהיו על גבי התמונה. להתאים את גודל בלוק כדי להשיג ממוצע של 20-30 בלוקים / תא. כדי להרכיב את הרשת מעל קליק התמונה על תיבת הסימון מול השדה "גודל הבלוק".
3. פרמטרים אופציונליים: אם תמונות בקנה מידה האוטומטית לא להציג סמנים עם עוצמות יחסי רצויים (למשל צבע אחד רווי) או אם סמנים צריכים להיות ירד מהניתוח, השתמשו באפשרות "להתאים את עוצמת ערוץ". כדי לזהות אזורים סלולריים על קבוצת משנה של סמנים להשתמש "ערוצים המשמשים לסף" אפשרות. אפשרויות ברירת מחדל של פרמטרים אחרים הן בדרך כלל נאותות, אבל אם נדרשו, התאימו אותם באמצעות "ניתוח מתקדם אפשרויות".
4. הרץ את הניתוח על ידי לחיצה על "PhenoRip" בלוח היישום הראשי. PhenoRipper יזהה באופן אוטומטי סוגים חוזרים בלוק בתמונות. פרופילים פנוטיפי יופקו עבורכל תמונה המבוססת על שברים מהסוגים השונים בגוש זה.

3. תוצאות היכרות

1. לחקור את יחסי הגומלין בין הפרופילים פנוטיפי של התמונות באמצעות PhenoBrowser (איור 1). ממשק PhenoBrowser מורכב מארבעה פנלים: הפנל השמאלי העליון הוא ייצוג גרפי (עלילת פיזור) של הדמיון היחסי בין תמונות / תנאים שונים, שני פנלים בתמונות מימין מדגם תצוגה של תנאים שנבחרו, והפנל הסופי (תרשים בר ) משווה פרופילים פנוטיפי שלהם.
2. "בטל מסגרות ריקות" שימוש בתפריט "עיבוד נתונים".
3. הסרת תמונות באיכות ירודה: ראשית, ללמוד תמונות בודדות לבטל את הקיבוץ מהתפריט "עיבוד נתונים". לאחר מכן, לחץ בנקודות החריגות בעלילת הפיזור ולהשליך תמונות באיכות נמוכות (לדוגמא, מחוץ לפוקוס, חפץ צביעה).
4. חקור את הנתונים: החלט שמטה מגדיר שדהיחידה בסיסית של השוואה (למשל כדי להשוות תרופות, תמונות עם אותו הערך של השדה מטה "תרופה" צריכים להיות מקובצים יחד). כווץ את כל התמונות עם אותו הערך של שדה זה metadata לנקודת נתונים יחיד עם "קיבוץ לפי". לדוגמא, קיבוץ לפי תרופה יהיה בממוצע התמונות בתוך כל תרופה להניב נקודה אחת לכל תרופה. נקודות סמוכות (או רחוקות) בעלילת הפיזור משקפות תנאים שיעוררו פנוטיפים סלולריים דומים (או שונים). נקודות צבע או תווית (תפריט תצוגת נתונים) המבוסס על מטה זמין כדי לסייע interpretability. עלילת 3D היא rotatable על ידי לחיצה על תיבת הסימון "rotatable" ועל ידי לחיצה על הכפתור השמאלי וגרירת העכבר מעליו.
5. בחר שתי נקודות שונות כדי להשוות אותם ישירות. פנלי התמונה יציגו תמונות לדוגמא עבור כל נקודה, ופנל תרשים העמודות יציג את הסוגים לחסום תדרי התרחשותם שונים ביותר בין שתי נקודות.
6. הפעל את גlustergram מ" תפריט Clustergram "כדי לספק מבט גלובלי יותר של מערכת היחסים בין סוגי אבן ותנאי ניסוי. על ידי קיבוץ שני סוגי הבלוק ותנאים, ייצוג זה מדגיש את פנוטיפים הסלולריים בצורה הטובה ביותר להבחין בין קבוצות של תנאים (איור 5).

תוצאות

כאן אנו בדקנו את היכולת של זרימת עבודה זו לסמים קבוצה המבוססת על מנגנון הפעולה שלהם. תאי הלה היו זורעים ב30 בארות של צלחת 384 גם ומוכתם עבור ה-DNA / אקטין / α-טובולין. הנוגדנים הספציפיים הראשוניים, נוגדנים משני fluorescently שכותרתו, וכתמי ניאון אחרים שהיו בשימוש מפורטים בטבלה של ...

Discussion

זרימת העבודה המתוארת כאן מאפשרת אפיון והשוואה של תמונות מיקרוסקופיה מהירים וקל. אנחנו הראשונים הוכיחו עד כמה זרימת עבודה זו יכולה לעזור אופטימיזציה של ניסוי, למשל על ידי ביצוע בקרת איכות במהירות בתמונות במיקרוסקופ. בשלב בא, שהראינו את הפוטנציאל שלה לניתוח נתונים הק?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, High Glucose	Invitrogen	11965	High Glucose, L-Glutamine
Marker Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock
Marker phalloidin-Alexa488	Invitrogen	A12379	Conjugated phallotoxin, dilution 1:200
Primary Antibody α-tubulin	Sigma	T9026	Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200
Secondary Antivody anti-Mouse TRITC	Jackson	115-025-166	Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol
Aldosterone			concentration used :0.2 μM
Apicidin			concentration used :20 μM
Colchicine			concentration used :0.16 μM
Cortisol			concentration used :0.2 μM
Dexamethasone			concentration used :0.2 μM
Docetaxel			concentration used :0.2 μM
M344			concentration used :20 μM
MS-275			concentration used :5 μM
Nocodazole			concentration used :0.3 μM
Prednisolone			concentration used :0.2 μM
RU486			concentration used :0.2 μM
Scriptaid			concentration used :70 μM
Taxol			concentration used :0.3 μM
Trichostatin A			concentration used :0.2 μM
Vinorelbine			concentration used :0.3 μM