Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Özet

Burada hızla PhenoRipper, son zamanlarda geliştirilmiş görüntü analiz platformu kullanarak floresan mikroskopi görüntülerin koleksiyonları analiz ve keşfetmek için bir iş akışını açıklar.

Özet

Yüksek verimli mikroskopi hızlı gelişmelere rağmen, kantitatif görüntü-tabanlı deneyler hala önemli sorunlar oluşturmaktadır. Özel görüntü analiz çeşitli araçlar mevcut olmakla birlikte, en geleneksel görüntü analizi tabanlı iş akışları (analiz parametreleri ince ayar için) dik bir öğrenme eğrileri ve görüntüleme ve analiz arasında uzun sürelerde sonuçlanır. Özellikle, hücre bölümleme, bir görüntüde tek hücrelerin belirlenmesi işlemi, bu konuda önemli bir darboğazdır.

Burada PhenoRipper, hızlı analiz ve mikroskopi görüntüleri keşif için tasarlanmış bir açık kaynak yazılım platformu dayalı bir alternatif, hücre-segmentasyon serbest iş akışı mevcut. Burada sunulan boru hattı hücre kültürlerinin immünofluoresans mikroskopi görüntüler için optimize edilmiş ve en az kullanıcı müdahalesi gerektirir. Yarım saat içinde, PhenoRipper tipik bir 96-kuyu deney verileri analiz ve görüntü profillerini oluşturabilir. Kullanıcılardaha sonra görsel, kendi veri keşfetmek onların deney kalite kontrolünü gerçekleştirmek, tedirginlikler tepki sağlamak ve suretin tekrarlanabilirlik kontrol edin. Bu analiz ve tahlil optimizasyonu sırasında önemlidir deney arasında hızlı bir geri besleme döngüsü kolaylaştırır. Bu protokol, sadece kalite kontrol için bir birinci geçiş analiz olarak yararlıdır, ama aynı zamanda bir uç uca bir çözüm olarak kullanılabilir, özellikle de taranması için kullanılabilir. Burada tarif edilen bu tür bir iş akışı, yüksek verimli taramalara tarafından üretilenler gibi büyük veri setleri için ölçekler, ve doğru bir biyolojik sistemlerin geniş bir aralık içinde bir fenotip ile grup, deney şartlarının gösterilmiştir. PhenoBrowser arayüzü fenotipik alanı keşfetmek ve biyolojik açıklamalar görüntü özelliklerini ilgili sezgisel bir çerçeve sağlar. Birlikte ele alındığında, burada açıklanan protokol görüntü tabanlı ekranların kantitatif analiz benimsenmesi için engelleri düşürecektir.

Giriş

Geçtiğimiz on yıl içinde, görüntüleme teknolojisindeki hızlı gelişmeler birçok laboratuarlara yüksek verimli mikroskobu gerçekleştirme yeteneğini verdik. Şimdi sorun analizi birine görüntüleme birinden kaymıştır. Nasıl karşılaştırmak, karakterize, ve tipik bir yüksek verimli görüntüleme ekranında tarafından üretilen karmaşık henüz ince fenotipleri sel keşfedebilirsiniz?

Görüntü analizi ve bilişim platformları bir dizi büyük koleksiyon görüntüleri biyolojik bilgi ayıklamak için kullanıcılar gelişmiş avadanlıklarını ^1-3 verdik. Ancak birçok önemli engel yüksek verimli görüntü-tabanlı ekranlar verileri analiz kalır. (Faiz sistemi) görüntüler ve algoritmik parametrelerin ince ayar uygun karakterizasyonlarını seçimi ile ilgili zorluklar sık ​​sık özellikle görüntü analiz uzmanlığı olmayan kullanıcılar için uzun kurulum süreleri, neden. Özellikle, hücre bölümleme, bir tek tek hücrelerin belirlenmesi sürecin görüntü, bu konuda önemli bir darboğaz olduğunu. Segmentasyon, hücre tipi, hücre yoğunluğu ve biyo-belirteçler gibi deneysel parametreler son derece duyarlı olması ve sık sık büyük bir veri kümesi için tekrarlanan ayar gerektirir. Bu nedenlerden dolayı, görüntü analizi genellikle oldukça deney akışı ayrılmaz bir parçası daha uzmanlarca yapılan bağımsız terminal adımdır. Bu analiz ve deney, tahlil kalkınmanın önemli bir parçası arasındaki hızlı geri besleme döngüsünü engellemektedir.

Burada yüksek verimli floresan mikroskobu için optimize edilmiş ve yukarıda bahsedilen zorluklarını bertaraf eder alternatif bir iş akışını açıklar. Bu amaçla, biz PhenoRipper ^4, hızlı arama ve mikroskopi görüntülerin analizi için bir açık kaynak yazılım platformu faydalanmak. Anlamlı, PhenoRipper tek hücreleri tanımlamak için çalışan değil, hücre segmentasyon ile ilgili birçok zorlukla önler. Bunun yerine, PhenoRipper piksel içine görüntüleri bölerhücre içi büyüklükte bloklar ve içerdikleri bloklar cinsinden görüntüleri karakterize etmektedir. Özellikle, PhenoRipper işaretleyici-ko-tabanlı özellikleri açısından blokları profilleri ve otomatik eğitim görüntülerde en iyi temsil eden blok tipleri ^4. tanımlar. PhenoRipper sonra her bloğun en benzer temsilcisi blok türü atar, ve nihayet içerdikleri blokların türlerine dayalı görüntüleri karakterize.

Daha geleneksel tek-hücreli-temelli yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında, bu yaklaşım, minimal ince ayar ve uzmanlık gerektirir. Blok boyutu ve grafik geribildirim ile ayarlanır ikisi de bir eşik yoğunluğu (görüntü hücresel olmayan kısımlarını atmak için), gibi:, kullanıcıların yalnızca iki parametrelerini ayarlamak gerekir. Önemlisi, burada anlatılan iş akışı hız ve minimal ince ayar geniş zaman ve güvenilirlik artışı sağlar, çok büyük veri setleri, kolayca ölçek ⁴ gösterilmiştir. Uygulamada, biz bulmak Bu uygulamayıroach gerek büyüklük ⁴ çoklu emir tarafından kurulum ve çalıştırma için gerekli süreyi azaltır.

PhenoRipper birincil çıkış hücreleri benzer fonetipler görüntülemek için neden deneysel koşullar gruplarını belirlemek için kullanıcı sağlayan, görüntü benzerlik görsel bir sunumudur. Tipik bulur PhenoRipper gruplaşmalar daha zaman alıcı, hücre tabanlı yöntemler ⁴ tarafından oluşturulan kıyaslanabilir "biyolojik yorumlanabilirliğini" var. Uygulamada, bu genellikle, tipik bir 96-sıra floresan mikroskopi deneyi gerçekleştirmek yarım saat içinde, önce görüntü analiz deneyimi olmayan bir deneyci kendi deney performansı hakkında güvenilir bir okuma almak anlamına gelir. Deneyci daha sonra farklı deneysel koşullar arasındaki ilişkileri keşfetmek ve görüntü fenotiplere bu ilişkileri ile ilgili başlayabilirsiniz.

Biz etkilerini analiz ederek burada bu iş akışını göstermekDNA ve sitoskeletal belirteçler için boyanmış HeLa hücreleri üzerinde ayrı mekanik sınıflarında ilaçların. Ilaçların aynı sınıf ile tedavi hücreleri görüntüleri gruplanmış, ve (böylece odak hücreleri ve dışarı boyama eserler) kalitesiz görüntüler belirlemek ve potansiyel atmak için onları kolay hale aykırı olarak ortaya çıktı.

Bu iş akışı görüntü tabanlı deneylerde çok sayıda için yararlı olsa da, farklı bir yaklaşım potansiyel olarak daha bilgilendirici olabilir açıkça birçok durum vardır. Örneğin, PhenoRipper gelen çıkış temel deneysel koşullar arasında floresan desen göreli bir karşılaştırılmasıdır. Belirli bir özelliği, tek bir hücre mutlak karakterizasyonu (a hücrede beneklerin örneğin sayısı) gerekli ise, tek hücre esaslı analiz gerekli olacaktır. Bununla birlikte, hatta bu tür durumlar içinde, PhenoRipper bu tek hücre fenotipleri değişiklikleri algılamak olasıdır ve bu nedenle tahlil opti için yararlı bir araç olabilirmizasyon.

Protokol

1.. Numune Hazırlanması ve Görüntüleme

1. Hücre kültürü
   1. Rutin kültürleri bölmek ve% 20-70 izdiham korumak. Deneyden önce bir gün, (Dulbecco Modified Eagle Medium Malzemelerin Tablo) DMEM içinde HeLa hücrelerinin büyümesi ve% 10 FBS (Fetal Sığır Serumu) ve 1 x penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir.
   2. Deney gününde, split hücreleri kültür (yaklaşık% 50 kaynaşık), büyüyen.
   3. Birkaç saniye tripsin / EDTA (Etilendiamintetraasetik asit), yaklaşık 2 ml maruz PBS (Fosfat Tamponlu Tuzlu Su) hücreleri yıkayın. Fazla tripsin / EDTA aspire ve ~ 3 dakika, oda sıcaklığında kaputu tripsin / EDTA ince film içinde kalmış hücreler tutun.
   4. Mekanik kez şişeler sallamak ve serumu medya ile hücreleri ayırmak. Hücre sayımı ve medya 5000 s/50 ul'ye seyreltilmiş ve hemen de otomatik bir sıvı kotarma robotu (sadece 30 kullanılarak 384 oyuklu cam alt plaka üzerine 50 ul / oyuk plakaPlakanın s) burada kullanılmaktadır.
   5. Oyuklara ⁵ kenar etkileri en aza indirmek için, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Gece boyunca, 37 ° C /% 5 _CO2 inkübatöründe RT kuluçkalandıktan sonra, plakalar bir yer.
   6. Her ilaç, iki kopya halinde deneye tabi tutulur. Plaka daha önce ortamı içeren karşılık gelen oyuklara ilacın 25 ul ekle.
   7. 24 saat sonrası ilaç tedavisi de PBS içinde% 4 paraformaldehid çözümü ile plaka düzeltmek.
2. Boyanma
   Burada kullanılan spesifik birincil antikorlar, floresan-etiketli sekonder antikorları ve diğer floresan lekeleri Malzemelerin Tablo l'de listelenmiştir.
   1. Permeabilize 3 dakika için TBS içinde% 0.2 Triton X-100 çözeltisi (Tris-tamponlu tuzlu su) ile hücreler sabitlenmiş ve TBST (Tris-tamponlu tuzlu su + Tween 20) 3x ile yıkayın. Bloke edilmesi için TBST içinde% 5 BSA (Bovin Serum Albumin) solüsyonu ekleyin.
   2. 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve daha sonra 3x TBST ile yıkayın.
   3. Primer antikor zaman dilüe olabilme olunTBST içinde% 5 BSA içinde iyonları (Malzemelerin Tablo bakınız) ve de 10 ul / ekleyin. 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve daha sonra 3 kez TBST ile yıkayın.
   4. TBST ikincil antikor dilutionin% 5 BSA (Materyallerin bkz. Tablo) yapmak ve de 10 ul / ekleyin.
   5. 2 saat boyunca oda sıcaklığında karanlıkta inkübe edin ve daha sonra iki kez de TBST ile yıkayın.
   6. PBS (Materyallerin bkz. Tablo) Hoechst ve Phalloidin için seyreltimler hazırlayın ve iyi 10 ul / ekleyin.
   7. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin.
   8. Sonra 2 TBST'dir yıkar, 4 ° CO / N. folyo ve mağaza kapak plakaları
3. Görüntüleme
   1x1 kamera binning ile 20X objektif kullanılarak Epifloresans bir mikroskop kullanılarak görüntü kazanır. 480 görüntüler (x3 kanal) toplam, her bir kuyu için onaltı görüntü kazanır.

2. Görüntüler incelendiğinde

Download ve phenoripper.org gelen PhenoRipper yüklemek ve IMA analiz başlamak için PhenoRipper başlatmakGes. PhenoRipper anda destekler TIFF, PNG, JPEG ve MATLAB tarafından desteklenen diğer tüm biçimler (mikroskop yazılımı tipik TIFF içine ihracatı desteklemek).

2.1 Yükleme Veri

1. Hiçbir standart adlandırma / kuruluş kuralı yükleme görüntüleri ve ilişkilendirerek meta yapabilirsiniz mikroskopi görüntüleri için var (örneğin tedavi türü, yani deneysel açıklama, kuyu sayısı ve benzeri) iş akışının en zor kısmı. (Aşağıda açıklanmıştır) sunulan yöntemlerin birini seçin.
   1. PhenoLoader: istediğiniz gibi dosya adı ve / veya dizin yapısı (örneğin, B16 HeLa_Drug5-DAPI.png görüntü kuyudan B16 uzak olduğunu gösterebilir grup görüntüleri için yeterli bilgi olduğunda veri yüklemek yarı-otomatik olarak bu seçeneği seçin, hücreler tedavi edilir Bu adlandırma kuralı, iyi A1 veya ilaç 5 ile tedavi edilen tüm görüntüleri kolayca gruplandırılmış olabilir) - Kimin kimliği 5 ve görüntü nükleer DAPI leke yakalar ilaç ile. Sihirbaz olacakgörüntü grupları ile meta ilişkilendirmek ve aşağıdaki gibi işaretçileri tanımlamak için adım kullanıcı adım rehberlik:
      1. PhenoLoader penceresine ulaşmak için "Dosya Yapısı" üzerine tıklayın.
      2. Görüntü veri kümesini içeren dizini seçmek için "Define Kök Dizin" üzerine tıklayın. Sonra analizi (opsiyonel, boş bırakılabilir) için kullanılmayan dosyaları (Kullanılmayan Dosya) filtre.
      3. Deneyde kullanılan biyomarkırları belirtmek ve görüntüleri ile ilişkilendirmek için "Define İşaretlerinin" üzerine tıklayın. Özellikle, o benzersiz biomarkerlerin tanımlayan dosya adının bir kısmını seçmek bir görüntü dosyasına tıklayın. Son olarak, her biyomarkere için bir ad girin.
      4. Her görüntü ile bilgileri ilişkilendirmek için "Define Meta" üzerine tıklayın. Özellikle, bir resim dosyası üzerine tıklatın ve sonra görüntü bilgilerini (kuyu adı örneğin "B16") tanımlayan dosya adının bir kısmını seçin. Bir pencere, bir grup adı (örneğin, "soran Bizll ") bir ad girin, açılır. dosya çıkarılan grubunun üyeleri), örneğin iyi isimleri tam listesi (grup tabloda gösterilir. dosya mevcut değil ek bilgi eklemek için tıklayın" (isteğe bağlı) Sonraki ", ek grup adı (örneğin enter" Meta Grup Ekle "düğmesine tıklayın. tıklayın" İlaç ") ve önceden tanımlanmış grubun her değer için (örneğin" Şey "), onun değerini girin (örneğin" Taxol ") . eklenebilir ek grupların sayısında bir sınır yoktur.
      5. Son olarak, meta veri dosyası oluşturmak ve analiz devam etmek için "Create Metadatafile" üzerine tıklayın. Bir meta veri dosyası daha önce oluşturulan olmuşsa, yukarıdaki adımları doğrudan seçeneği (aşağıda 3 tarif) "detayları Dosya" kullanarak dosya yükleme ile önlenebilir.
   2. Düzenli İfade Tabanlı Templates: Düzenli ifadeler desen eşleştirme için standart bir yaklaşım vardırmetin. Dosya adı ve / veya dizin yapısı grup görüntüleri için yeterli bilgi ve adlandırma kuralı önceden varolan şablonlardan birini maçları bu seçeneği seçin. Düzenli ifadeler dayalı özel şablonlar elle de tanımlanabilir ve tekrar edilebilir. Bu gelişmiş seçenek sadece düzenli ifadelerle aşina kullanıcılar için önerilir.
   3. Dosya: nihai Customizability için bu seçeneği seçin. Tanımlayın ve bir virgülle ayrılmış değerler her bir görüntü ile ilişkili dosya isimleri ve meta verileri içeren (CSV) dosyası yükleyin. Dosya biçimi bir örnek web sitesinde (phenoripper.org) bir yükleme kısmında mevcuttur. Basitçe içerdiği bilgileri görüntülemek için arayüz üzerinden dosya yüklenemedi.
2. Gereksiz örnekleme önlemek için deneyde çoğaltır tanımlayan meta alanını seçin. Göstrm olabilir (iyi örneğin) onları bir araya gruplama, çoğaltır (bir kuyuda örneğin tüm görüntüleri aynı olmalıdır) içeren veri setleri içinove performans. Çoğu durumda bu rastgele bir alt kümesini seçer varsayılan seçenek "Random (bilmiyorum)" seçmek için makul.

2.2 Analiz Parametreleri Ayarlama

Veri kümesini işlemek için gereken parametreleri tanımlamak için "Set Parametreleri" üzerine tıklayın. Tanımlamak için parametreler sol panelde bulunmaktadır. Sağ panel veri kümesi birleştirilmiş bir örneğini görüntüler. Farklı görüntüler arasında geçiş yapmak için sağ / sol oklara tıklayın.

1. Eşik Yoğunluk: kabaca görüntülerin hücre kısımlarını (yerine arka plan, hücresel-olmayan bölgeleri) tanımlamak için uygun bir eşik değer seçin. Bir eşik PhenoRipper tarafından önceden hesaplanmış, ancak görüntünün üstünde mevcut scrollbar kullanarak hücresel bölgelerin vurgulamasını geliştirmek için ayarlanabilir. Seçilmiş bir eşik Tüm görüntüler üzerinde işe yaramazsa, hücresel olmayan bölgeleri yerine hücresel bölgeleri bırakarak içerecek şekilde eşiğini düşürmek.
2. Blok Size: ızgaraya görüntüyü (piksel) uygun bir blok boyutu seçin. Belirtilen boyutta bloklar görüntü üzerine bindirilmiş olacaktır. 20-30 Taşları / hücrenin bir ortalama elde etmek için blok boyutunu ayarlayın. "Block Size" alanına önündeki onay kutusunu görüntü tıklama üzerinden ızgara bindirmek için.
3. Opsiyonel Parametreler: auto-ölçekli görüntüleri istenilen göreli yoğunlukları ile işaretçileri (örn. tek renk doymuş) görüntülemek veya belirteçleri analiz düştü gerekiyorsa, "Kanal ve yoğunluğunu ayarlayın" seçeneğini kullanın yoksa. Belirteçlerin bir alt hücresel bölgelerini belirlemek için seçenek "Eşik için kullanılan Kanallar" kullanın. Diğer parametrelerin varsayılan seçenek genellikle yeterli olmaktadır, ancak gerekirse, "İleri Analiz Seçenekleri" kullanarak ayarlayın.
4. Ana uygulama panelde "PhenoRip" tuşuna basarak analizi çalıştırın. PhenoRipper otomatik olarak görüntüler tekrarlayan blok tiplerini belirlemek olacaktır. Fenotipik profilleri için üretilecektiriçinde farklı blok tipleri fraksiyonların göre her görüntüsü.

3. Keşfetmek Sonuçlar

1. PhenoBrowser (Şekil 1) kullanılarak görüntülerin fenotipik profilleri arasındaki ilişkiyi araştırmak. PhenoBrowser arayüzü dört panel oluşur: Sol üst paneli farklı görüntüler / şartlar arasındaki göreceli benzerlik grafik bir temsilidir (dağılım arsa), seçildikleri koşulların sağ ekran örnek görüntüler ve son panelinde (çubuk grafik üzerindeki iki panel ) fenotipik profillerini karşılaştırır.
2. "Bilgi İşlem" menüsünü kullanarak "Boş Çerçeveler atın".
3. Kalitesiz görüntüleri kaldırmak: Birincisi, bireysel görüntüler "Veri İşleme" menüsünden gruplama kapatmak çalışma. Sonraki, dağılım arsa Aykırı noktaları aracılığıyla tıklayın ve (örneğin, odak dışında, boyama paraziti) düşük kaliteli görüntüler atın.
4. Verileri keşfedin: alan tanımlar meta karar verinkarşılaştırma temel bir birim (örneğin uyuşturucu karşılaştırmak için, meta alanın aynı değeri "uyuşturucu" ile görüntüler gruplanmış gerekir). "Grup By" ile tek bir veri noktası içine bu meta alanın aynı değeri ile tüm görüntüleri kapa. Örneğin, bir ilaç ile bir ilaç gruplama her bir nokta elde etmek için her bir ilacın içindeki görüntüleri ortalamasını alır. Dağılım arsa yakın (veya uzak) puan benzer (ya da farklı) hücresel fenotipleri ortaya koşullarını yansıtır. Yorumlanabilirliğini yardımcı olmak için mevcut meta dayalı renkli veya etiket noktaları (veri görüntüleme menüsü). 3D arsa "döner" onay kutusunu ve sol butonuna tıklayarak ve üzerinde fareyi sürükleyerek tıklayarak döndürülebilir.
5. Onları doğrudan karşılaştırmak için iki farklı sayı seçin. Görüntü panelleri her bir nokta için örnek görüntüleri olacak ve çubuk grafik paneli olan olay frekansları iki nokta arasındaki en farklı blok tipleri gösterecektir.
6. C başlatınblok tipleri ve deneysel koşulları arasındaki ilişkinin daha küresel bir görünüm sağlamak için "Clustergram menüden" lustergram. Blok tipleri ve koşulları hem gruplandırarak, bu temsili en iyi koşullarda grupları (Şekil 5) ayırt hücresel fenotipleri vurgulamaktadır.

Sonuçlar

Burada etki mekanizmasına göre grubu ilaçlara bu iş akışının kabiliyetini test etmiştir. HeLa hücreleri, 384 oyuklu plakanın 30 kuyu tohumlanmış ve DNA / aktin / α-tubulin için boyandı. Kullanılan spesifik birincil antikorlar, floresan-etiketli sekonder antikorları ve diğer floresan lekeleri Malzemelerin Tablo l'de listelenmiştir. Wells üç mekanik sınıflarına (histon deasetilaz önleyici, mikrotübül ve hedef DNA hasar verici) 24 saat için ve 20X objektif büyütme Epifloresans mikroskop k...

Tartışmalar

Burada anlatılan iş akışı, hızlı ve kolay karakterizasyonu ve mikroskopi görüntülerin karşılaştırılmasını sağlar. Biz öncelikle bu iş akışı hızlı mikroskopi görüntüleri kalite kontrolü gerçekleştirerek, örneğin deney optimizasyon, nasıl yardımcı olabileceğini gösterdi. Sonra, yüksek verimli tarama verilerini analiz etmek için kendi potansiyelini gösterdi: Biz etki mekanizmasına dayalı grup ilaçlarla başardık. Ilaçların grup PhenoRipper daha hızlı olan büyüklüklerdir o...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM, High Glucose	Invitrogen	11965	High Glucose, L-Glutamine
Marker Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock
Marker phalloidin-Alexa488	Invitrogen	A12379	Conjugated phallotoxin, dilution 1:200
Primary Antibody α-tubulin	Sigma	T9026	Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200
Secondary Antivody anti-Mouse TRITC	Jackson	115-025-166	Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol
Aldosterone			concentration used :0.2 μM
Apicidin			concentration used :20 μM
Colchicine			concentration used :0.16 μM
Cortisol			concentration used :0.2 μM
Dexamethasone			concentration used :0.2 μM
Docetaxel			concentration used :0.2 μM
M344			concentration used :20 μM
MS-275			concentration used :5 μM
Nocodazole			concentration used :0.3 μM
Prednisolone			concentration used :0.2 μM
RU486			concentration used :0.2 μM
Scriptaid			concentration used :70 μM
Taxol			concentration used :0.3 μM
Trichostatin A			concentration used :0.2 μM
Vinorelbine			concentration used :0.3 μM